本技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种工程化的趋化因子受体及其应用。
背景技术：
1、过继性免疫细胞治疗(adoptive cell therapy,act)是指从肿瘤患者分离免疫活性细胞，在体外对其进行扩增与功能鉴定后，再回输给患者，从而直接杀伤肿瘤，或激发机体的免疫应答从而杀伤肿瘤细胞。
2、免疫治疗(immunotherapy)是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)t细胞技术是新近迅速发展的一种细胞免疫治疗技术。
3、目前，嵌合抗原受体t细胞(car-t)治疗，在清除血液类的癌症中取得了傲人成绩，但在实体瘤中的效果普遍不好。多重因素可能成为阻碍car-t成功治疗实体肿瘤的原因。其中包括肿瘤的抗原表达，局部差异化或抗原丢失均可使car-t失效；肿瘤的缺氧、免疫抑制微环境；和t细胞对肿瘤的定向迁移等因素均可影响car-t的治疗效果。经过改造、回输后的car-t细胞必须能够和癌症源的趋化因子配对从而成功地到达实体肿瘤的位置，并且要成功地穿过实体肿瘤的基质细胞后才能激发出肿瘤抗原特异性的细胞毒性杀伤。传统的car-t由于设计相对简单，因此也更容易受实体瘤的免疫抑制微环境影响，限制了car-t细胞治疗技术在实体瘤范围的应用。
4、目前，传统car-t设计大多只着重于通过优化、或加减嵌合抗原受体(car)的区域，增强t细胞激活和增生等功能，或单纯的利用趋化因子信号使car-t向目标肿瘤迁移。但即利用趋化因子信号的趋化作用，同时又发挥趋化因子对t细胞的活化作用，并没有见到任何报道。
技术实现思路
1、本技术提供了一种可用于改善工程化免疫细胞向恶性肿瘤的趋化能力的嵌合型趋化因子受体，可为恶性肿瘤尤其是实体瘤治疗提供了新的可选方案。
2、具体的，本技术一方面提供了一种嵌合型趋化因子受体，其包含部分或全部的cxcr2胞外区和部分或全部的cxcr3胞内区。在一些实施方案中，所述部分cxcr2胞外区包含cxcr2胞外1区至4区中的一个或多个。在一些实施方案中，所述部分cxcr3胞内区包含cxcr3胞内1区至4区中的一个或多个。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子受体为七次跨膜蛋白，从n端到c端依次包含胞外1区、跨膜1区、cxcr3胞内1区、跨膜2区、胞外2区、跨膜3区、cxcr3胞内2区、跨膜4区、胞外3区、跨膜5区、cxcr3胞内3区、跨膜6区、胞外4区、跨膜7区、以及cxcr3胞内4区。在一些实施方案中，所述胞外1至4区可依次分别包含任何七次跨膜的趋化因子受体的胞外1至4区。在一些实施方案中，所述跨膜1至7区可依次分别包含任何七次跨膜的趋化因子受体的跨膜1至7区。在一些实施方案中，所述胞外1至4区和所述跨膜1至7区来自同一种趋化因子受体。在一些实施方案中，所述胞外1至4区分别依次包含cxcr2的胞外1至4区。在一些实施方案中，所述跨膜1至7区分别依次包含cxcr3的跨膜1至7区。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子受体从n端到c端依次包含cxcr2胞外1区、跨膜1区、cxcr3胞内1区、跨膜2区、cxcr2胞外2区、跨膜3区、cxcr3胞内2区、跨膜4区、cxcr2胞外3区、跨膜5区、cxcr3胞内3区、跨膜6区、cxcr2胞外4区、跨膜7区、以及cxcr3胞内4区。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子从n端到c端由下述结构依次连接而成：cxcr2胞外1区、跨膜1区、cxcr3胞内1区、跨膜2区、cxcr2胞外2区、跨膜3区、cxcr3胞内2区、跨膜4区、cxcr2胞外3区、跨膜5区、cxcr3胞内3区、跨膜6区、cxcr2胞外4区、跨膜7区、以及cxcr3胞内4区。在一些实施方案中，所述连接为直接连接。在一些实施方案中，所述连接为间接连接。在一些实施方案中，所述间接连接为通过连接肽的连接。在一些实施方案中，所述cxcr2胞外1区至cxcr2胞外4区依次分别包含如seq id no：1至4所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述cxcr2胞外1区至cxcr2胞外4区依次分别为如seq id no：1至4所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述cxcr3胞内1区至cxcr3胞内4区依次分别包含如seq id no：23至26所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述cxcr3胞内1区至cxcr3胞内4区依次分别为如seq id no：23至26所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述跨膜1区至跨膜7区分别包含cxcr2跨膜1区至跨膜7区。在一些实施方案中，所述跨膜1区至跨膜7区分别为cxcr2跨膜1区至跨膜7区。在一些实施方案中，中所述cxcr2跨膜1区至跨膜7区依次分别包含如seq id no：9至15所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，中所述cxcr2跨膜1区至跨膜7区依次分别为如seq id no：9至15所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子受体包含如seq id no：31所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no：31所示或为其保守取代变体。在一些实施方案中，所述嵌合型趋化因子受体的氨基酸序列与seq id no：31所示的氨基酸序列具有80％以上序列同一性，例如具有85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、或99％以上序列同一性。
3、本技术的第二方面提供了靶向恶性肿瘤的组合物，其包含前述第一方面的嵌合型趋化因子受体或其编码核酸分子。在一些实施方案中，所述靶向恶性肿瘤的组合物至少包含前述第一方面的嵌合型趋化因子受体和car。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体直接连接。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体间接连接。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体通过连接肽连接。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体通过自剪切多肽连接。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体通过2a肽连接。在一些实施方案中，所述car与所述嵌合型趋化因子受体互不连接。在一些实施方案中，所述靶向恶性肿瘤的组合物至少包含编码前述第一方面的嵌合型趋化因子受体的核酸分子和编码car的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为dna、rna或dna与rna的杂合分子。在一些实施方案中，所述核酸分子为mrna。在一些实施方案中，所述核酸分子经过化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰选自：硫代修饰、胆固醇修饰、m6a、m1a、m5c、m7g、ac4c、2’-o-甲基化及假尿嘧啶替换。在一些实施方案中，所述核酸分子不包含化学修饰。在一些实施方案中，所述组合物靶向的恶性肿瘤选自：
4、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌、小肠癌、食管癌、黑色素瘤、骨癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾盂癌、脊柱肿瘤、胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤，上述任何肿瘤的组合，以及上述肿瘤的转移病灶。
5、在一些实施方案中，所述car特异性结合肿瘤抗原，所述肿瘤抗原包含选自下述的任一种或多种：
6、cd19、cd123、mov-γ、psma、cdh17、dll-1、folr-1、muc16、tag-72、claudin18.2、cldn6、grp78、c-met、b7h3、gucy2c、mg7、ny-eso-1、cd44v6、cspg4、il13rα2、egfrviii、egfr、epcam、gd2、muc1、her2、gpc3、cea、meso(mesothelin，间皮素)、cd133、nkg2d、cd138、ley、κ轻链、cd33、ror1、bcma、cd30、cd20、cd22、psca、cll-1、cd70、cd47、claudin、erbb。
7、在一些实施方案中，所述car依次包含胞外区、跨膜区和胞内区。在一些实施方案中，所述胞外区包含抗cea的scfv氨基酸序列，所述scfv的氨基酸序列如seq id no：33或其保守取代变体所示。在一些实施方案中，所述car的跨膜区为cd8α的跨膜区。在一些实施方案中，所述car的跨膜区包含如seq id no：41所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述胞内区包含cd28的胞内区、cd137的胞内区和/或cd3ξ的胞内区。在一些实施方案中，所述胞内区包含cd137的胞内区和cd3ξ的胞内区。在一些实施方案中，所述car的胞内区包含如seq id no：43所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述car的胞内区包含如seq id no：45所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述car的胞内区依次包含如seq id no：43和seq id no：45所示的氨基酸序列或它们的保守取代变体。在一些实施方案中，所述胞外区与所述跨膜区由cd8α的铰链区相连。在一些实施方案中，所述car的铰链区包含如seq id no：39所示的氨基酸序列或其保守取代变体。在一些实施方案中，所述组合物包含如seq id no：35所示的氨基酸序列或其保守取代突变体。在一些实施方案中，所述组合物的氨基酸序列如seq id no：35所示的氨基酸序列或其保守取代突变体所示。一些实施方案中，所述组合物的氨基酸序列与seq id no：35所示的氨基酸序列具有80％以上序列同一性，例如具有85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、或99％以上序列同一性。
8、本技术的第三方面提供了一种核酸分子，其包含编码前述嵌合型趋化因子受体或前述组合物的多核苷酸序列，和/或所述多核苷酸序列的互补序列。在一些实施方案中，所述核酸分子还进一步包含调控所述嵌合型趋化因子受体、所述组合物、或所述组合物中的car表达的缺氧可调控启动子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码前述组合物的多核苷酸序列，其中所述嵌合型趋化因子受体的编码序列与所述car的编码序列通过内部核糖体进入位点(ires)相连。在一些实施方案中，核酸分子包含选自下组的多核苷酸序列中的一个或多个：seq id no：5至8、seq id no：16至22、seq id no：27至30、seq id no：32、seq id no：34、seq id no：36、seq id no：38、seq id no：40、seq id no：42、seq id no：44、seq id no：46、seq id no：48、及seq id no：50。在一些实施方案中，所述核酸分子为mrna。在一些实施方案中，所述核酸分子经过化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰选自：硫代修饰、胆固醇修饰、m6a、m1a、m5c、m7g、ac4c、2’-o-甲基化及假尿嘧啶替换。在一些实施方案中，所述核酸分子不包含化学修饰。
9、本技术还进一步提供了表达载体，其包含根据前述核酸分子，所述表达载体选自：质粒、线性核酸、病毒表达载体。
10、本技术的第四方面提供了一种递送体，其包含前述的嵌合型趋化因子受体，前述组合物，前述核酸，或前述表达载体，所述递送体选自：脂质体、脂质纳米颗粒、噬菌体、病毒颗粒或假病毒颗粒、囊泡。在一些实施方案中，所述递送体包含前述组合物，且前述嵌合型趋化因子受体或编码所述嵌合型趋化因子受体的核酸分子，以及car或编码所述car的核酸分子，分别位于不同递送体中。
11、本技术的第五方面还提供了一种工程化免疫细胞，其包含前述嵌合型趋化因子受体，前述组合物，前述核酸或前述递送体。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞，其为：t细胞、nk细胞、巨噬细胞、dc细胞、b细胞，或上述免疫细胞的前体细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞是在细胞膜上包含前述嵌合型趋化因子受体的car-t细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞是在细胞膜上包含前述嵌合型趋化因子受体的car-nk细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞是在细胞膜上包含前述嵌合型趋化因子受体的tcr-t细胞。
1.一种嵌合型趋化因子受体，包含部分或全部cxcr2胞外区和部分或全部cxcr3胞内区。
2.根据权利要求1的嵌合型趋化因子受体，其中所述部分或全部cxcr2胞外区包含cxcr2胞外1区至cxcr2胞外4区中的任一个或多个，所述部分或全部cxcr3胞内区包含cxcr3胞内1区至cxcr3胞内4区中的任一个或多个。
3.根据权利要求1的嵌合型趋化因子受体，其为七次跨膜蛋白，从n端到c端依次包含cxcr2胞外1区、跨膜1区、cxcr3胞内1区、跨膜2区、cxcr2胞外2区、跨膜3区、cxcr3胞内2区、跨膜4区、cxcr2胞外3区、跨膜5区、cxcr3胞内3区、跨膜6区、cxcr2胞外4区、跨膜7区、以及cxcr3胞内4区。
4.根据权利要求2或3的嵌合型趋化因子受体，其中所述cxcr2胞外1区至cxcr2胞外4区依次分别包含如seq id no：1至4所示的氨基酸序列或其保守取代变体。
5.根据权利要求2或3的嵌合型趋化因子受体，其中所述cxcr3胞内1区至cxcr3胞内4区依次分别包含如seq id no：23至26所示的氨基酸序列或其保守取代变体。
6.用于靶向恶性肿瘤的组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合型趋化因子受体。
7.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合型趋化因子受体或根据权利要求6所述的组合物的多核苷酸序列，和/或所述多核苷酸序列的互补序列。
8.一种表达载体，其包含根据权利要求7所述的核酸分子，所述表达载体选自：质粒、线性核酸、病毒表达载体。
9.一种递送体，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合型趋化因子受体，根据权利要求6所述的组合物，根据权利要求7所述的核酸分子，或根据权利要求8所述表达载体，所述递送体选自：脂质体、脂质纳米颗粒、噬菌体、病毒颗粒或假病毒颗粒、及囊泡。
10.一种工程化免疫细胞，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合型趋化因子受体，根据权利要求6所述的组合物，或根据权利要求7所述的核酸分子。
