本发明涉及一种检测甲基化半胱氨酸总量的方法和试剂盒，属于生物技术和分析测试领域。
背景技术：
1、甲基化半胱氨酸(hcy)是甲硫氨酸代谢产生的中间产物。在人体中，有大约98％-99％的hcy通过二硫键与蛋白、氨基酸形成复合物，仅有1％-2％的hcy以游离态存在。正常人血清中hcy总量(thcy)在5-15微摩每升(μm)，小于6微摩每升是最佳的数值。临床医学研究表明，心血管系统疾病、糖尿病、高血压等疾病的患者的thcy浓度高于正常值。因此，血清thcy浓度检测已经成为心脑血管类疾病临床诊断和普通人健康体检的一项重要内容。现有检测thcy的方法主要有高效液相色谱法、放射免疫分析法、酶循环法。其中，高效液相色谱法依赖高昂的仪器设备、熟练的技术人员，因此不便于在基层单位使用。放射免疫分析法需要使用放射性试剂，安全性差。酶循环法检测步骤相对简单，安全性好，是目前医院检验科进行thcy检验的主流方法。
2、酶循环法利用底物和辅酶的循环反应,使酶促反应产物不断生成，是一种基于多种酶连续催化反应的比色检测方法(图1)。首先，使用还原剂将氧化型hcy还原为游离型hcy。然后，游离型hcy在hcy甲基转移酶的催化作用下，与s-腺苷甲硫氨酸(sam)反应形成甲硫氨酸、s腺苷同型半胱氨酸(sah)。sah被sah水解酶水解生成腺苷和hcy。生成的hcy进入下一轮循环反应，继续生成sah，进而生成腺苷。腺苷水解为次黄苷和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使还原型辅酶i(nadh)转化为氧化型辅酶i(nad)。样本中的hcy浓度与nad浓度的变化呈正比。通过检测nad在340nm处的紫外可见吸收，来实现对thcy的定量检测。酶循环法需要准确控制反应时间，依赖进口设备；试剂种类多、成本高，且需要2-8度储存，不得冷冻；开瓶后2-8度避光稳定仅7天。目前只能在实验室进行检测，且检测结果易受内源性干扰。因此，迫切需要快速、廉价的检测thcy的方法。
3、核酸适配体是一种具有独特空间构型、可以特异性识别多种类型靶标的单链dna或rna分子。核酸适配体通过体外筛选技术获得，可以通过化学合成得到，批次之间性能差异较小，热稳定性好，而且成本较低。近些年来，基于核酸适配体的快速检测方法备受关注，目前已经实现对抗生素、毒素等多种小分子靶标的快速、灵敏检测。hcy的dna核酸适配体文献中已有报道(5’accagcacattcgattataccagcttattcaattcacagctatgtcctataccagcttattcaatt-3’,rscadv.,2013,3,24415–24422)，解离常数为600±300纳摩尔每升(nm)。将该核酸适配体与纳米金结合，实现了对游离hcy的比色检测。在10％血清中标准添加游离hcy，检测限(lod，s/n＝3)为0.5μm(对100％血清相当于5μm)，动力学区间为0.5–3.0μm(rscadv.,2013,3,24415–24422)。将该核酸适配体与电化学传感器结合，实现了对游离hcy的电化学检测，在缓冲液中的lod为0.01μm，动力学区间为0.05–20.0μm(bioelectrochemistry,2020,134,107497)。但是该方法受血清基质的影响很大，对50％血清中游离hcy的检出限高于1μm(对100％血清相当于2μm)。正常人血清中游离hcy的浓度约为50nm-0.3μm，因此上述两篇文献所报道的方法的灵敏度差，均无法检测出血清中游离hcy。特别是，上述方法都是检测的游离hcy，不能用于thcy的检测。
4、倏逝波光纤荧光传感器是一种便携式光学传感器，基于光波在光纤内以全反射的方式传输时，在光疏介质一侧的界面上产生的倏逝波的独特现象。利用倏逝波激发光纤表面上的荧光基团的能力，通过检测荧光强度的变化来实现对各种类型待测物含量的定量检测。
技术实现思路
1、本发明中，我们通过倏逝波光纤法检测病人血清的thcy浓度。如图2所示,血清中hcy除了游离hcy之外，还存在三种氧化态的hcy复合物。本发明中，利用对游离hcy具有高响应(处于纳摩尔每升水平范围的解离常数)、对氧化态hcy具有中等响应的(处于微摩尔每升水平范围的解离常数)核酸适配体构建倏逝波光纤传感器。该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链和hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合。荧光信号的下降值与血清中thcy浓度正相关。根据荧光降低百分数来计算血清中的thcy浓度。本发明检测thcy仅需要1微升血清，将血清稀释1000倍后进行检测，检测结果与商业酶循环法一致。与酶循环法相比，本发明方法具有价格低(光纤可重复使用30次以上)、检测速度快(最快5分钟)、不需要酶、设备小型化、操作简单等优点，具有极好临床应用价值。
2、本发明提供一种检测甲基化半胱氨酸总量的方法，利用对游离hcy具有高响应、对氧化态hcy具有中等响应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器。该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链、还原态hcy、氧化态hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合，还原态(游离态)hcy和氧化态hcy的浓度越高，越多的光纤上固定的核酸适配体与其结合，与荧光标记的互补链结合的核酸适配体越少，荧光响应值越低。荧光信号的下降值与血清中thcy浓度正相关，根据荧光降低百分数来计算血清中的thcy浓度。另外，光纤界面上的吐温80纳米层对hcy进行原位富集，极大地提高了光纤界面附近的还原态hcy和氧化态hcy的浓度，更加促进了其与光纤上固定的核酸适配体的结合，荧光响应值更低，因而检测灵敏度更高。将含不同thcy浓度的血清在缓冲液中稀释1千倍，或者将血清与还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)的混合液在缓冲液中稀释1千倍，再加入终浓度为20nm的带cy5.5修饰的互补链，经过以下三个步骤将混合物引入光纤传感器：(1)泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)耗时20秒将靶标和互补链的混合物泵入光纤反应池并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入0.5％sds,ph 1.9洗涤缓冲液冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的互补链，重复(1)-(3)，进行下一个样品的检测。以thcy浓度为横坐标，以相对荧光信号下降百分比为纵坐标绘制工作曲线。如前述的方法进行真实样本中thcy的检测。根据荧光信号的响应值，利用工作曲线计算thcy的浓度。
3、所述的本发明的检测甲基化半胱氨酸总量的方法中，还原态hcy和氧化态hcy均能够与光纤上固定的核酸适配体结合，但是核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力。当血清稀释10000倍进行检测时，荧光信号值的下降主要由还原态hcy和核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态hcy的浓度。当血清稀释1000倍进行检测时，荧光信号值的下降由还原态hcy、氧化态hcy、核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态和氧化态hcy的总浓度thcy。另外，由于核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，通过加入tcep将血清中的氧化态hcy部分还原为还原态游离的hcy，可以提高荧光信号的响应值，从而提高检测的准确度。可以通过调控tcep还原反应的时间和tcep的浓度，调控荧光信号的响应值。
4、本发明还提供了一种检测甲基化半胱氨酸总量的试剂盒，包括荧光基团cy5.5修饰的hcy核酸适配体的互补序列、缓冲液、还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)、界面再生试剂(0.5％十二烷基磺酸钠，简称sds，ph1.9)。
5、在前述的试剂盒中，其利用对游离hcy具有高响应、对氧化态hcy具有中等响应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器，该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链、还原态hcy、氧化态hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合，还原态(游离态)hcy和氧化态hcy的浓度越高，越多的光纤上固定的核酸适配体与其结合，与荧光标记的互补链结合的核酸适配体越少，荧光响应值越低，荧光信号的下降值与血清中thcy浓度正相关，根据荧光降低百分数来计算血清中的thcy浓度，另外，光纤界面上的吐温80纳米层对hcy进行原位富集，极大地提高了光纤界面附近的还原态hcy和氧化态hcy的浓度，更加促进了其与光纤上固定的核酸适配体的结合，荧光响应值更低，因而检测灵敏度更高，将含不同thcy浓度的血清在缓冲液中稀释1千倍，或者将血清与还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)的混合液在缓冲液中稀释1千倍，再加入终浓度为20nm的带cy5.5修饰的互补链，经过以下三个步骤将混合物引入光纤传感器：(1)泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)耗时20秒将靶标和互补链的混合物泵入光纤反应池并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入0.5％sds,ph 1.9洗涤缓冲液冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的互补链，重复(1)-(3)，进行下一个样品的检测，以thcy浓度为横坐标，以相对荧光信号下降百分比为纵坐标绘制工作曲线，如前述的方法进行真实样本中thcy的检测，根据荧光信号的响应值，利用工作曲线计算thcy的浓度。
6、在前述的试剂盒中，还原态hcy和氧化态hcy均能够与光纤上固定的核酸适配体结合，但是核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，当血清稀释10000倍进行检测时，荧光信号值的下降主要由还原态hcy和核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态hcy的浓度，当血清稀释1000倍进行检测时，荧光信号值的下降由还原态hcy、氧化态hcy、核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态和氧化态hcy的总浓度thcy，另外，由于核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，通过加入tcep将血清中的氧化态hcy部分还原为还原态游离的hcy，可以提高荧光信号的响应值，从而提高检测的准确度，可以通过调控tcep还原反应的时间和tcep的浓度，调控荧光信号的响应值。
7、在前述的试剂盒中，所述hcy核酸适配体的互补序列为：5’-gatgcctgtgaa-cy5.5-3’。
8、另外，在前述的试剂盒中，tcep是hcy检测时常用的还原剂。sds是常用的表面活性剂和双链dna的变性试剂。
9、本发明方法具有如下优势：
10、1)价格便宜：酶循环法价格一般在50元-120元/次。由于光纤可以多次循环再生(>30次)，单次检测成本低(<1元)。
11、2)超快检测：酶循环法需要2-3小时检测时间。本发明检测检测血清中thcy最快5分钟。
12、3)面向社区和家庭使用：由于现有检测技术的复杂性，目前通常大型医院才能进行hcy的检测。本发明方法设备小型化、便宜、免维护、操作简单，仅需经过简单培训即可独立完成。可以在社区医院甚至家庭中普及，使人们能够更方便地检测血清中thcy的含量。
13、4)仅需1微升血液：本发明方法可以在千分之一的血清中准确的检测出thcy的含量，血液需要量极少，减少病人痛苦。
14、5)试剂种类少、货期长：酶循环法需要的试剂种类多，2-8度储存，不得冷冻；开瓶后2-8度避光稳定7天。本发明方法仅需要光纤探头和缓冲液、还原剂、界面再生试剂、荧光标记互补探针，且均为化学合成试剂，稳定性好。光纤2-8度稳定大于2个月；试剂盒冷冻室稳定1年以上。
1.一种检测甲基化半胱氨酸总量的方法，，其特征在于，利用对游离hcy具有高响应、对氧化态hcy具有中等响应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器，该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链、还原态hcy、氧化态hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合，还原态(游离态)hcy和氧化态hcy的浓度越高，越多的光纤上固定的核酸适配体与其结合，与荧光标记的互补链结合的核酸适配体越少，荧光响应值越低，荧光信号的下降值与血清中thcy浓度正相关，根据荧光降低百分数来计算血清中的thcy浓度，另外，光纤界面上的吐温80纳米层对hcy进行原位富集，极大地提高了光纤界面附近的还原态hcy和氧化态hcy的浓度，更加促进了其与光纤上固定的核酸适配体的结合，荧光响应值更低，因而检测灵敏度更高，将含不同thcy浓度的血清在缓冲液中稀释1千倍，或者将血清与还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)的混合液在缓冲液中稀释1千倍，再加入终浓度为20nm的带cy5.5修饰的互补链，经过以下三个步骤将混合物引入光纤传感器：(1)泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)耗时20秒将靶标和互补链的混合物泵入光纤反应池并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入0.5％sds,ph1.9洗涤缓冲液冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的互补链，重复(1)-(3)，进行下一个样品的检测，以thcy浓度为横坐标，以相对荧光信号下降百分比为纵坐标绘制工作曲线，如前述的方法进行真实样本中thcy的检测，根据荧光信号的响应值，利用工作曲线计算thcy的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还原态hcy和氧化态hcy均能够与光纤上固定的核酸适配体结合，但是核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，当血清稀释10000倍进行检测时，荧光信号值的下降主要由还原态hcy和核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态hcy的浓度，当血清稀释1000倍进行检测时，荧光信号值的下降由还原态hcy、氧化态hcy、核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态和氧化态hcy的总浓度thcy，另外，由于核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，通过加入tcep将血清中的氧化态hcy部分还原为还原态游离的hcy，可以提高荧光信号的响应值，从而提高检测的准确度，可以通过调控tcep还原反应的时间和tcep的浓度，调控荧光信号的响应值。
3.一种检测甲基化半胱氨酸总量的试剂盒，其特征在于，其包括荧光基团cy5.5修饰的hcy核酸适配体的互补序列、缓冲液、还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)、界面再生试剂(0.5％十二烷基磺酸钠，简称sds，ph1.9)。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其利用对游离hcy具有高响应、对氧化态hcy具有中等响应的核酸适配体构建倏逝波光纤传感器，该传感器基于竞争检测模式，荧光标记的互补链、还原态hcy、氧化态hcy与光纤上固定的核酸适配体竞争结合，还原态(游离态)hcy和氧化态hcy的浓度越高，越多的光纤上固定的核酸适配体与其结合，与荧光标记的互补链结合的核酸适配体越少，荧光响应值越低，荧光信号的下降值与血清中thcy浓度正相关，根据荧光降低百分数来计算血清中的thcy浓度，另外，光纤界面上的吐温80纳米层对hcy进行原位富集，极大地提高了光纤界面附近的还原态hcy和氧化态hcy的浓度，更加促进了其与光纤上固定的核酸适配体的结合，荧光响应值更低，因而检测灵敏度更高，将含不同thcy浓度的血清在缓冲液中稀释1千倍，或者将血清与还原剂三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称tcep)的混合液在缓冲液中稀释1千倍，再加入终浓度为20nm的带cy5.5修饰的互补链，经过以下三个步骤将混合物引入光纤传感器：(1)泵入缓冲液30秒清洗进样管道和光纤反应池，保证基线平稳；(2)耗时20秒将靶标和互补链的混合物泵入光纤反应池并保持180秒，实时测定荧光信号；(3)通入0.5％sds,ph1.9洗涤缓冲液冲洗30秒，冲洗掉与光纤表面结合的互补链，重复(1)-(3)，进行下一个样品的检测，以thcy浓度为横坐标，以相对荧光信号下降百分比为纵坐标绘制工作曲线，如前述的方法进行真实样本中thcy的检测，根据荧光信号的响应值，利用工作曲线计算thcy的浓度。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，还原态hcy和氧化态hcy均能够与光纤上固定的核酸适配体结合，但是核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，当血清稀释10000倍进行检测时，荧光信号值的下降主要由还原态hcy和核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态hcy的浓度，当血清稀释1000倍进行检测时，荧光信号值的下降由还原态hcy、氧化态hcy、核酸适配体的互补链与与光纤上固定的核酸适配体的竞争结合引起，根据荧光信号值可以检测还原态和氧化态hcy的总浓度thcy，另外，由于核酸适配体对还原态hcy的亲和力远高于对氧化态hcy的亲和力，通过加入tcep将血清中的氧化态hcy部分还原为还原态游离的hcy，可以提高荧光信号的响应值，从而提高检测的准确度，可以通过调控tcep还原反应的时间和tcep的浓度，调控荧光信号的响应值。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述hcy核酸适配体的互补序列为：5’-gatgcctgtgaa-cy5.5-3’。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，tcep是hcy检测时常用的还原剂，sds是常用的表面活性剂和双链dna的变性试剂。
