本发明涉及一种用于标记目标结构体的标签、包含多个该标签的标记物结构体和用于检查标记有该标记物结构体的目标结构体的方法。
背景技术：
1、为了解决生命科学领域的关键问题，对生物样品(例如组织样品或细胞培养物)、环境样品(土壤样品)、水样品、诊断程序(例如在固体或液体活组织检查或由其制备的样品中)或此类样品的裂解物或提取物中目标结构体(例如分子或蛋白质)的存在进行精确检测是至关重要的。这可以通过将与特定目标结构体(例如，特定的生物分子)结合的标记物结构体引入到样品中来完成。这些标记物通常包含亲和试剂和荧光染料，亲和试剂附着于目标结构体，荧光染料直接缀合于该亲和试剂或通过第二亲和试剂附着于该亲和试剂。多种技术可用于分析以这种方式制备的生物样品。荧光显微镜中的复用(plexing)水平(即可同时读出的不同荧光染料的数量)通常较低，并且在荧光显微镜的情况下用于基于通道的读出通常在1-5种染料的范围内，而用于通过使用色散光学元件的光谱检测器(例如棱镜或光栅与多个检测器或阵列检测器的组合)的读出通常在5-12种染料的范围内。在基于荧光的细胞计数和分选中，已获得了较高的复用水平，但在这种情况下，复用也仅限于少量的染料，因此能够在一次实验中读出的标记物的数量也较少。
2、显微镜、细胞计数和其他应用领域的多路复用(multiplexing)受限于荧光发射和激发的光谱重叠。因此，希望进一步增加可变化的参数的数量以允许更高的复用水平。
技术实现思路
1、目的是提供一种有别于荧光标签的且允许简单生成紧凑标记物结构体的标签。
2、上述目的是通过根据权利要求1所述的标签来实现的。有益实施例限定于从属权利要求和以下描述中。
3、具体地，提供了一种用于标记目标结构体的标签，所述标签包含至少一种聚炔烃和至少一种寡核苷酸，其中所述至少一种聚炔烃被配置为通过独特(distinct)拉曼光谱学特征是可检测的。
4、因此，该标签是可通过拉曼光谱学检测的并有别于通常使用的荧光标签。聚炔烃是致使标签紧凑的小分子，该紧凑标签可借助于寡核苷酸被轻松灵活地附着。
5、优选地，独特拉曼光谱学特征是受激拉曼散射(stimulated raman scattering，srs)特征或相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes raman scattering，cars)特征。例如，可以通过拉曼显微镜测量拉曼光谱学特征。
6、优选地，所述标签还包含至少一个第一荧光团，该第一荧光团被配置为通过至少独特光谱特征是可检测的。这通过参数的更多样化使得能够生成彼此间可区分的标签。第一荧光团的光谱特征可以例如是激发波长和/或发射波长。
7、优选地，所述标签还包含至少一个第二荧光团，该第二荧光团被配置为通过至少独特荧光寿命特征是可检测的。这通过参数的更多样化使得能够生成彼此间可区分的标签。此外，第一荧光团和第二荧光团可通过各自的其他独特荧光特征检测。例如，第一荧光团可通过独特荧光寿命特征来区分。
8、优选地，所述标签包含由所述至少一种聚炔烃和所述至少一种寡核苷酸形成的至少一种缀合物。
9、优选地，所述至少一种缀合物还包含所述至少一个第一荧光团和/或至少一个第二荧光团。
10、优选地，所述标签被配置为被附着至与所述目标结构体结合的亲和试剂。这使得该标签能够特异性结合到目标结构体。例如，所述标签的寡核苷酸可以附着至亲和试剂的互补序列。该亲和试剂可以是对目标结构体具有特异性亲和力的抗体。
11、根据另一方面，提供了一种包含多个所述标签的标记物结构体。该多个标签使得能够生成更多样化的可被单独地区分的标记物结构体的集。
12、优选地，所述多个标签中的所述标签在它们各自的聚炔烃的独特拉曼光谱学特征、和/或它们的第一荧光团的光谱特征和/或它们的第二荧光团的荧光寿命特征方面至少部分地与彼此不同。这使得能够生成更多可区分的标记物结构体。
13、优选地，所述标记物结构体包含仅包含荧光团的标签。这使得能够生成更多可区分的标记物结构体。
14、优选地，所述标记物结构体包含在其上附着有所述标签的骨架。这使得标记物结构体特别地稳固。
15、优选地，所述骨架由基于dna纳米技术的结构体形成，或者所述骨架由凝胶状结构体形成。这使得标记物结构体能够被特别灵活地组装。特别地，凝胶状结构体可包含聚乙二醇(peg)。
16、例如所述骨架包含支架链(scaffold strand)和装订链(staple strand)，所述装订链被配置为在预定位置结合至所述支架链以将所述支架链折叠成预定形状。这样的骨架可以是dna折纸(origami)。这些dna折纸结构体可以在几纳米到几微米的大小范围内。为了制造这种基于dna折纸的结构体，较长的dna分子(支架链)在被所谓的装订链所精确识别的位置被折叠。dna折纸可以被设计成提供特定的预定形状的自组装骨架。这使得骨架的合成和组装简单且可重复。装订链可以是位置选择性地功能化的。在这种情况下，位置分辨率受到核苷酸大小的限制，其在纳米或纳米以下的范围内。这已经在现有技术中被用于生成荧光标准物，其中荧光染料被连接至dna折纸上精确定位的条带(band)。这些标准物被称为“纳米尺”，并用于成像系统的校准，如共聚焦或超分辨率显微镜(例如sted)(例如如us2014/0057805a1所公开的)。
17、dna折纸为标签提供了支架。优选地，所述dna折纸结构包含至少一条支架链和多条装订链，其中所述装订链与所述支架链的至少一部分互补并被配置成使所述支架链形成预定构象。特别地，所述链是寡核苷酸。这使得能够生成可自组装的具有预定二维或三维形状的骨架。此外，这使得能够将标签的附着位点在所述骨架上进行位点特异性放置。
18、所述附着位点是唯一性的(unique)核酸序列，优选是对于装订链。优选地，所述标签可以在预定的附着位点处附着到骨架的装订链上。由于所述装订链位于预定位置处，因此等同于所述附着位点的位置可以是预定的。因此，(核酸骨架上的)附着位点是与一个标签的附着寡核苷酸部分相互补的唯一性的寡核苷酸序列。
19、可选地，所述骨架可包含dna砖块(brick)或由dna砖块组成。这些dna砖块是长度较短的寡核苷酸，其具有相互重叠的杂交延伸段(stretch)，以便与彼此结合并组装所述骨架。在这种情况中，所述标签的寡核苷酸可以形成核酸骨架的组成部分。可选地，dna砖块的较短长度的寡核苷酸上的附着位点可致使所述标签的寡核苷酸的结合。
20、优选地，通过沿着或围绕所述骨架在各标签的所述第一荧光团和/或所述第二荧光团间插入布置有所述聚炔烃，而对所述第一荧光团和/或所述第二荧光团进行激子(excitonically)解耦。这使得能够特别精确地测量附着于标记物结构体的标签的荧光团的荧光性质。
21、在另一方面中，提供了一种用于检查目标结构体的方法，包括以下步骤：用所述标记物结构体来标记目标结构体；测量所标记的目标结构体的拉曼光谱学特征；和测量所标记的目标结构体的荧光。
22、所测量的拉曼光谱学特征例如是受激拉曼散射(srs)特征或相干反斯托克斯拉曼散射(cars)特征。
23、优选地，测量所标记的目标结构体的荧光包括检测所述标记物结构体的光谱特征和/或检测所述标记物结构体的荧光寿命特征。这使得能够在大量的标记物结构体之间进行相互区分。
24、优选地，通过显微镜测量所述拉曼光谱学特征和所述荧光中的至少一种，或使所述拉曼光谱学特征和所述荧光中的至少一种成像。特别地，这使得能够生成目标结构体的相应图像并且定位所标记的目标结构体。
25、优选地，通过细胞计数器(cytometer)测量拉曼光谱学特征和荧光中的至少一种。这使得能够特别快速地识别所标记的目标结构体。
26、优选地，该方法还包括基于所测量的拉曼光谱学特征和/或所测量的荧光对所标记的目标结构体进行分选的步骤。例如，可以基于荧光光谱特征和/或荧光寿命特征的测量进行荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，facs)。
1.一种用于标记目标结构体(508、510)的标签(100、102、206、208、404、406、408、514、604、606、712、714)，包含至少一种聚炔烃(104、110)和至少一种寡核苷酸(106)，其中所述至少一种聚炔烃(104、110)被配置为通过独特拉曼光谱学特征是可检测的。
2.根据权利要求1所述的标签，其中所述独特拉曼光谱学特征为受激拉曼散射(srs)特征或相干反斯托克斯拉曼散射(cars)特征。
3.根据权利要求1或2所述的标签，还包含至少一个第一荧光团(108、112、414、516)，其中所述至少一个第一荧光团(108、112、414、516)被配置为通过至少独特光谱特征是可检测的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的标签，还包含至少一个第二荧光团(108、112、414、516)，其中所述至少一个第二荧光团(108、112、414、516)被配置为通过至少独特荧光寿命特征是可检测的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的标签，包含至少一种缀合物，其中所述至少一种缀合物由所述至少一种聚炔烃(104、110)和所述至少一种寡核苷酸(106)形成。
6.根据权利要求5所述的标签，其中所述至少一种缀合物还包含所述至少一个第一荧光团(108、112、414、516)。
7.根据权利要求5或6所述的标签，其中所述至少一种缀合物还包含所述至少一个第二荧光团(108、112、414、516)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的标签，其中所述标签被配置为被附着至与所述目标结构体(508、510)结合的亲和试剂(504、506)。
9.一种标记物结构体(200、300、400、500、502、600、602、700、702、704)，包含根据前述权利要求中任一项所述的多个标签。
10.根据权利要求9所述的标记物结构体，其中所述多个标签中的标签在它们各自的聚炔烃(104、110)的独特拉曼光谱学特征、和/或它们的第一荧光团的光谱特征和/或它们的第二荧光团的荧光寿命特征方面至少部分地与彼此不同。
11.根据权利要求9或10所述的标记物结构体，包含在其上附着有所述标签的骨架(202、402、608)。
12.根据权利要求11所述的标记物结构体，其中所述骨架(202、402、608)由基于dna纳米技术的结构体形成，或者其中所述骨架由凝胶状结构体形成。
13.根据权利要求11或12所述的标记物结构体，其中通过沿着或围绕所述骨架(202、402、608)在所述第一荧光团和/或所述第二荧光团间插入布置有所述聚炔烃而对所述第一荧光团和/或所述第二荧光团进行激子解耦。
14.一种用于检查目标结构体的方法，所述方法包括以下步骤：
15.根据权利要求14所述的方法，其中测量所标记的目标结构体的荧光包括检测所述标记物结构体的光谱特征和/或检测所述标记物结构体的荧光寿命特征。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中通过显微镜测量所述拉曼光谱学特征和所述荧光中的至少一种。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中通过细胞计数器测量所述拉曼光谱学特征和所述荧光中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括基于所测量的拉曼光谱学特征和/或所测量的荧光对所标记的目标结构体进行分选的步骤。
