本发明属于测序文库构建，具体涉及一种rna-seq建库的方法。
背景技术：
1、转录本水平的定量对于解析基因的分子功能和调控网络都具有重要意义。因此，人们开发了各种方法来测量基因的转录水平，包括逆转录和半定量聚合酶链反应，基于微阵列的芯片技术和转录组测序（rna-seq）。这些方法的出现和兴起极大地促进了我们对基因表达及其潜在调控机制的理解。其中，测序技术的出现彻底改变了我们分析转录本水平的能力。
2、一个典型的rna-seq实验需要一个由信使rna（mrna）转录本生成的dna文库。常用的方案包括几个关键步骤，包括rna提取、poly-a选择或核糖体rna缺失、逆转录、二级链互补dna（cdna）合成、适配器连接和最终的文库扩增。然而，由于样本在文库构建过程中是单独处理的，传统的转录组测序并不适用于大规模样本，并且还受到成本和人力的限制。此外，典型的转录组测序需要覆盖每个基因的整个转录本，因此需要足够的测序量，才能获得可靠的结果。作为普通转录组测序的替代方法，已经开发了许多靶向末端转录组测序方法，如聚腺苷化位点测序等。这些方法可以减少测序覆盖范围，从而降低测序成本。然而，这些基于末端的方法只能一次处理一个rna样本，并且不能有效地同时处理许多样本。然而，许多类型的研究需要大量样本，如高分辨率时空基因表达分析，植物和人类基因组的群体规模基因表达变异分析等，这些方法很难实现。
3、建库过程中用到的最关键的酶是tn5转座酶，虽然tn5在高通量测序中已被广泛采用，但生物信息学分析和结构研究表明，它属于逆转录病毒整合酶超家族，理论上不仅能作用于dsdna，还作用于rna/dna杂交链。传统的文库构建过程中需要形成cdna二链，需要dna去除、多聚（a）富集或核糖体rna（rrna）去除，人工和试剂成本较高。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种rna-seq建库的方法。
2、一种rna-seq建库的方法，包括如下步骤：
3、（1）提取样品rna，进行反转录，获得rna/dna杂交链；所述反转录采用的引物包括条形码和分子识别器；
4、（2）采用磁珠法对步骤（1）制备的rna/dna杂交链进行浓缩和纯化；
5、（3）采用tn5片段化rna/dna杂交链；
6、（4）pcr扩增建库；所述pcr引物包括条形码。
7、所述条形码和分子识别器设置在oligo d（t）引物上游。
8、所述条形码是一段固定的8碱基dna序列，有48个组合，不同的样本用不同的8碱基进行区分。
9、所述分子识别器是6个n，反转录的时候加到单链cdna上， pcr建库根据分子识别器进行去重，使表达数据更准确。
10、本发明的有益效果：本发明通过在oligo d （t）引物上游加入独特的条形码和分子识别器（umi），该引物在逆转录酶的作用下，结合mrna的末端，并形成互补dna（cdna）链，这样就可以通过条形码区分每个样本，之后将不同样本产生的cdna进行混样，利用磁珠进行纯化和富集，之后利用tn5片段化dna/rna杂交链，并将特定的测序适配器加到杂交链上，然后通过pcr扩增并富集转录本的端，大大简化了建库过程，节省了试剂和耗材用量，减少了文库测序和分析所需的测序数据量。利用来自玉米，高粱，水稻，拟南芥，小鼠和人类证明，与典型的rna-seq方法相比，quic3rna-seq在定量基因表达方面具有较高的重现性、准确性和敏感性。quic3rna-seq是高通量转录组分析的最佳方法，每个样本的文库构建的平均成本仅为4元，约为传统rna-seq成本的二十分之一，它的成本比测序基因分型（gbs）还低，是目前所有测序方法中最节约成本的方法，而且兼容性多种实验室常用的酶，真正的使rna-seq进入普通实验室中。
1.一种rna-seq建库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述rna-seq建库的方法，其特征在于，所述条形码和分子识别器设置在oligo d（t）引物上游。
3.根据权利要求1所述rna-seq建库的方法，其特征在于，所述条形码是一段固定的8碱基dna序列，有48个组合，不同的样本用不同的8碱基进行区分。
4.根据权利要求1所述rna-seq建库的方法，其特征在于，所述分子识别器是6个n，反转录的时候加到单链cdna上， pcr建库根据分子识别器进行去重，使表达数据更准确。
