本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种脂肪脱细胞基质冻干组合物及其制备方法。
背景技术：
1、脂肪脱细胞基质中含有活性蛋白、生长因子和多型胶原等活性成分，不仅具有良好的生物相容性，还具有诱导脂肪细胞增殖分化等作用，注射脂肪脱细胞基质在治疗各种创伤、疾病和衰老带来的软组织容积缺失或肤质改善等方面有很好效果。
2、不同g数的针头适用于软组织不同层次的注射，如20-25g的针头可以用于面部皮下组织深层注射；25-30g的针头可以用于面部真皮组织的注射；30g及以上的针头可以用于浅表皮肤的注射。冷冻干燥工艺可以最大程度的保留脂肪脱细胞基质的活性，并延长其保存时间。但经冷冻干燥处理后脂肪脱细胞基质会发生缠结和团聚等现象，使其难以复溶均匀，无法通过小口径针头进行注射，而不同口径针头分别用于软组织不同层次的注射，因此常规冷冻干燥处理后的产品限制了其临床应用。
3、因此有必要提供一种新的脂肪脱细胞基质冻干组合物及其制备方法，减少冻干过程中带来的不利影响，以解决现有技术的不足。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种脂肪脱细胞基质冻干组合物及其制备方法。
2、在本发明的第一方面，提供了一种脂肪脱细胞基质冻干组合物，所述冻干组合物通过以下方法制备，所述方法包括步骤：
3、a、将脂肪脱细胞基质与助剂混合，得到调配的脂肪脱细胞基质乳液；
4、b、将调配的脂肪脱细胞基质乳液进行冻干，得到所述脂肪脱细胞基质冻干组合物；
5、其中，所述助剂包括助剂a和任选地助剂b；所述助剂a为糖类和多元醇，优选包括甘露醇、海藻糖、蔗糖中的一种或几种；所述助剂b包括甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、卡波姆、海藻酸钠、阿拉伯胶中的一种或几种。
6、在另一优选例中，所述助剂a为甘露醇。
7、在另一优选例中，所述助剂b选自下组：甘油、聚乙二醇，或其组合。
8、在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量为100-2000，优选100-1000，例如200、400、600、800。
9、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中，所述脂肪脱细胞基质的浓度为0.1-40mg/ml，优选0.5-30mg/ml，更优选1-25mg/ml，例如3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。
10、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中，所述助剂a的质量浓度为0.1-30mg/ml，优选0.5-25mg/ml，更优选0.5-20mg/ml，例如1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml。
11、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中，所述助剂b的浓度为10-500μl/ml，优选20-200μl/ml，更优选50-200μl/ml，例如100μl/ml。
12、在另一优选例中，当所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中含有助剂b时，所述脂肪脱细胞基质的浓度为0.1-40mg/ml，优选0.5-30mg/ml，更优选1-25mg/ml，例如3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。
13、在另一优选例中，当所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中不含有助剂b时，所述脂肪脱细胞基质的浓度为0.1-30mg/ml，优选0.5-25mg/ml，更优选1-20mg/ml，例如3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。
14、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中包含1-5mg/ml脂肪脱细胞基质和0.5-15mg/ml甘露醇。
15、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中包含1-5mg/ml脂肪脱细胞基质和5-15mg/ml海藻酸。
16、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中包含1-5mg/ml脂肪脱细胞基质、5-15mg/ml甘露醇和50-200μl/ml甘油。
17、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中包含1-40mg/ml脂肪脱细胞基质、5-15mg/ml甘露醇和50-200μl/ml peg 400。
18、在另一优选例中，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中包含1-20mg/ml脂肪脱细胞基质和5-15mg/ml甘露醇。
19、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质通过以下方法制备，所述方法包括：
20、s1：清洗
21、提供一脂肪组织原料，将所述脂肪组织原料破碎，并进行漂洗，从而获得经漂洗的脂肪组织；
22、s2：前处理
23、(1)对所述经漂洗后的脂肪组织进行离心，获得分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层；
24、(2)对所述中间层进行匀浆处理，后处理得到固体层；
25、(3)对所述步骤(2)中的固体层进行漂洗处理，得到固体层；
26、其中，所述漂洗处理包括将步骤(2)中的固体层与脱脂试剂混合，所述脱脂试剂为碱性物质、第一醇类物质和聚乙二醇醚的混合水溶液；
27、s3：病毒灭活
28、对所述步骤s2中(3)的固体层使用病毒灭活试剂处理，得到固体层；
29、其中，所述病毒灭活处理包括将固体层与病毒灭活试剂混合，所述的病毒灭活试剂包括过氧化物和第二醇类物质的水溶液；
30、s4：脱细胞
31、对所述步骤s3中的固体层使用脱细胞试剂处理，获得脂肪脱细胞基质。
32、在另一优选例中，所述方法中没有添加生物酶。
33、在另一优选例中，所述方法的总反应时间小于72小时，优选小于48小时，更优选小于24小时。
34、在另一优选例中，所述的步骤s1还包括：将脂肪组织原料静置，去除下层肿胀液。
35、在另一优选例中，所述的步骤s1中，使用生理盐水进行漂洗。
36、在另一优选例中，所述的步骤s1中，漂洗的次数为2-5次，例如3次。
37、在另一优选例中，所述的步骤s1包括：将脂肪直立静止，去除肿胀液后，用生理盐水漂洗3-5遍。
38、在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述离心的转速为200-20000g，较佳地2000-16000g，最佳地8000-12000g。
39、在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述离心的时间为1-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
40、在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述中间层为包含脂肪细胞的脂肪层。
41、在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述分层的混合物分为3层，上层为油层，中间层为包含脂肪细胞的脂肪层，下层为水层。
42、在另一优选例中，所述的步骤(1)包括：将经漂洗后的脂肪组织以10000g离心3分钟，获得分层的混合物，去除上层油层和下层水层，收集中间层(即含脂肪细胞的脂肪层)。
43、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的匀浆为机械匀浆。
44、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述匀浆处理包括通过匀浆机进行破碎匀浆。
45、在另一优选例中，所述匀浆机的转速为5000-15000r/min，优选8000-15000r/min，例如10000r/min、12000r/min。
46、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述匀浆处理的时间为0.5-15min，较佳地1-10min，更佳地1-8min，最佳地1-5min。
47、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的转速为200-20000g，较佳地2000-16000g，最佳地8000-12000g。
48、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述离心的时间为2-20min，较佳地5-15min，更佳地10min。
49、在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述后处理包括离心分离，收集固体层的步骤。
50、在另一优选例中，所述的步骤(2)包括：对步骤(1)得到的中间层以10000r/min的转速匀浆1分钟，之后10000g离心分离，收集固体层。
51、在另一优选例中，所述的步骤(3)中，所述混合包括振荡混合。
52、在另一优选例中，所述的步骤(3)中，所述步骤(2)中的固体层与所述脱脂试剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:6、1:8、1:10。
53、在另一优选例中，所述振荡混合的时间为0.5-8h，优选2-8h，例如3h、4h。
54、在另一优选例中，所述的碱性物质选自下组：氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠，或其组合。
55、在另一优选例中，所述的第一醇类物质选自下组：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，或其组合。
56、在另一优选例中，所述的聚乙二醇醚选自下组：脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚，或其组合。
57、在另一优选例中，所述碱性物质在脱脂试剂中的浓度为1mmol/l-100mmol/l。
58、在另一优选例中，所述第一醇类物质在脱脂试剂中的体积分数为50-100％，优选50-95％。
59、在另一优选例中，所述聚乙二醇醚在脱脂试剂中的体积分数为0.1-5％。
60、在另一优选例中，所述的步骤(3)还包括：对脱脂试剂后的混合物分离，弃去液体层，得到固体层。
61、在另一优选例中，所述分离包括离心分离，或静置后直接吸取液体层，从而弃去液体层。
62、在另一优选例中，所述的步骤(3)包括：对步骤(2)中的固体层以一定比例加入脱脂试剂，振荡混合一段时间后弃去液体层，收集固体层。
63、在另一优选例中，所述的步骤(3)包括：对步骤(2)中的固体层以1：10的质量比加入氢氧化钠、异丙醇、聚乙二醇辛基苯基醚的水溶液，振荡混合3小时后弃去液体层，收集固体层。
64、脱细胞基质的制备方法需要根据使用的目标组织的不同特性来选择，并根据组织中细胞特性、密度和脂质含量等进行工艺方法的整合。由于脂肪组织中含有80％以上的脂质，脂质黏附在基质表面导致后续处理工艺中脱细胞剂处理的效率下降。本发明通过匀浆、离心和漂洗的组合方法可以去除脂肪组织中绝大多数脂质，大大减少了后期脱细胞处理时间，提高了脂肪脱细胞基质的制备效率。
65、在另一优选例中，所述的步骤s3中，所述混合包括振荡混合。
66、在另一优选例中，所述的步骤s3中，所述病毒灭活处理包括将固体内容物添加到病毒灭活试剂中，进行混合。
67、在另一优选例中，所述过氧化物选自下组：过氧化氢、过氧乙酸、二氧化氯、臭氧，或其组合。
68、在另一优选例中，所述第二醇类物质选自下组：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇，或其组合。
69、在另一优选例中，所述过氧化物在所述病毒灭活试剂中的体积分数为0.05-3％，优选0.1-2％，更优选0.1-1％，例如0.5％。
70、在另一优选例中，所述醇类物质在所述病毒灭活试剂中的体积分数为1-24％，优选2-20％，更优选2-10％，例如4％、5％、8％。
71、在另一优选例中，所述的步骤s3中，所述步骤s2中(3)的固体层与所述病毒灭活试剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:8、1:10。
72、在另一优选例中，所述振荡混合的时间为0.5-6h，优选1-6h，例如4h。
73、在另一优选例中，所述的步骤s3还包括：对病毒灭活试剂后的混合物分离，弃去液体层，之后对余下的固体层进行洗涤，得到固体层。
74、在另一优选例中，所述分离包括离心分离，或任选地静置后直接吸取液体层，从而弃去液体层。
75、在另一优选例中，所述洗涤包括：使用pbs溶液和/或水进行洗涤。
76、在另一优选例中，所述洗涤包括：先用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗。
77、在另一优选例中，所述的步骤s3包括：将步骤s2中(3)的固体层以一定比例添加进病毒灭活试剂中振荡混合，处理后液体层弃掉，余下的固体依次用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗，氯化钠溶液振荡清洗获得固体层。
78、在另一优选例中，所述的步骤s3包括：将步骤s2中(3)的固体层以1:10的质量比添加进浓度为0.5％/4％的过氧乙酸/乙醇消毒剂中振荡混合4小时，处理后液体层弃掉，余下的固体依次用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗，获得固体层。
79、在另一优选例中，所述的步骤s4中，所述脱细胞处理包括将固体内容物与脱细胞试剂混合。
80、在另一优选例中，所述混合包括振荡混合。
81、在另一优选例中，所述的步骤s4中，所述脱细胞处理包括将固体内容物添加到脱细胞试剂中，进行混合。
82、在另一优选例中，所述的步骤s4中，所述脱细胞处理包括将固体内容物添加到脱细胞试剂中，混合一段时间后，更换新的脱细胞试剂，继续混合。
83、在另一优选例中，所述脱细胞试剂为表面活性剂的水溶液。
84、在另一优选例中，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂中的一种或几种。
85、在另一优选例中，所述表面活性剂选自sds、tritonx-100、脱氧胆酸钠的一种或多种。
86、在另一优选例中，所述表面活性剂在所述脱细胞试剂中的体积分数为0.2-5％，优选0.5-2％，更优选0.8-1.5％，例如1％。
87、在另一优选例中，所述的步骤s4中，所述步骤s3的固体层与所述脱细胞试剂的质量比为1:1～1:20，优选1:2～1:20，更优选1:5～1:20，例如1:8、1:10。
88、在另一优选例中，所述振荡混合的时间为1-12h，优选4-12h，例如1h、2h、4h、8h、12h。
89、在另一优选例中，所述混合包括先振荡处理t1小时，之后进行换液，再振荡处理t2小时。
90、在另一优选例中，t1、t2各自独立地为2-6h，例如4h。
91、在另一优选例中，所述换液是指更换新的脱细胞试剂。
92、在另一优选例中，所述换液包括：分离，弃去液体层，再加入新的脱细胞试剂。
93、在另一优选例中，所述的步骤s4还包括：对脱细胞试剂处理后的混合物分离，弃去液体层，之后对余下的固体层进行洗涤，得到固体层。
94、在另一优选例中，所述分离包括离心分离，或任选地静置后直接吸取液体层，从而弃去液体层。
95、在另一优选例中，所述洗涤包括：使用pbs溶液和/或水进行洗涤。
96、在另一优选例中，所述洗涤包括：先用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗。
97、在另一优选例中，所述的步骤s4包括：将步骤s3的固体层以一定比例添加进浓度为脱细胞试剂中振荡混合，处理后液体层弃掉，余下的固体依次用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗，获得固体层。
98、在另一优选例中，所述的步骤s4包括：将步骤s3的固体层以1:10的质量比添加进浓度为1％tritonx-100中振荡混合8小时，每4小时换液1次，处理后液体层弃掉，余下的固体依次用pbs溶液振荡清洗，纯化水振荡清洗，获得脂肪脱细胞基质。
99、在另一优选例中，所述脱脂试剂处理、病毒灭活试剂处理中，任选地还包括清洗的后处理步骤。
100、在另一优选例中，所述清洗包括依次进行pbs溶液清洗，纯化水清洗。
101、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质为同种异体或同种同体脂肪脱细胞基质。
102、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质不含有细胞且不含有脂滴。
103、在另一优选例中，所述脂滴为脂肪细胞破碎后释放的油滴。
104、在另一优选例中，所述“不含有脂滴”指所述脂肪脱细胞生物材料中，油滴体积占总液体百分比小于1％，优选地小于0.5％，更优选地小于0.1％。
105、在另一优选例中，所述细胞选自下组：内皮细胞、脂肪干细胞、巨噬血细胞、基质细胞。
106、在另一优选例中，所述“不含有细胞”指1ml脂肪脱细胞生物材料中的细胞平均数量≤1个，优选地≤0.5个，更佳地≤0.1个，或为0个。
107、在另一优选例中，所述所述脂肪脱细胞基质中的dna含量相比未处理的脂肪细胞降低了80％以上，优选90％以上，更优选95％以上。
108、在另一优选例中，所述步骤a还包括：将脂肪脱细胞基质在水中物理破碎，得到脂肪脱细胞基质乳液。
109、在另一优选例中，所述物理破碎包括使用刀式匀浆机、乳化机、超声波细胞破碎仪、组织研磨机、气流粉碎机和高压匀浆机的一种或多种进行物理破碎。
110、在另一优选例中，所述物理破碎包括匀浆。
111、在另一优选例中，所述匀浆包括刀式匀浆和高压匀浆。
112、在另一优选例中，所述匀浆包括10000～20000rpm刀式匀浆3～10min，再500～2000bar压力下高压匀浆1～5个循环。
113、在另一优选例中，所述水为纯化水。
114、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质乳液的微粒粒径为0.5～1000μm，优选10～500μm。
115、在另一优选例中，所述步骤b中，冻干包括预冷冻、升华干燥和解析干燥。
116、在另一优选例中，所述预冷冻包括：先0～-8℃保温0.2～1h，然后-15～-30℃保温2～5h，最后-30～-70℃保温1～5h。
117、在另一优选例中，所述升华干燥包括：先-30～-70℃保温10～25h，再先0～-8℃保温0.5～3h。
118、在另一优选例中，所述解析干燥包括10～35℃保温2～8h。
119、在另一优选例中，所述步骤b中，还包括将调配的脂肪脱细胞基质乳液注入模具，之后进行冻干的步骤。
120、在另一优选例中，所述模具选自下组：不同规格的托盘、西林瓶、玻璃注射器，或其组合。
121、在另一优选例中，所述冻干组合物通过以下方法制备，所述方法包括步骤：
122、a1、将脂肪脱细胞基质与水匀浆混合，得到脂肪脱细胞基质乳液；
123、a2、将脂肪脱细胞基质乳液与助剂混合，得到调配的脂肪脱细胞基质乳液；
124、b、将调配的脂肪脱细胞基质乳液进行冻干，得到所述脂肪脱细胞基质冻干组合物。
125、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物不含有细胞且不含有脂滴。
126、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的粒径d(0.1)小于26μm，优选10～26μm，更优选10～25μm。
127、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的粒径d(0.5)小于135μm，优选50～130μm，更优选70～125μm。
128、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的粒径d(0.9)小于400μm，优选100～350μm，更优选150～300μm。
129、在另一优选例中，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物具有选自下组的一个或多个特征：
130、(1)所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的复溶时间小于30min，优选为5～25min，更优选为5～20min；
131、(2)所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的复溶后稳定时间大于10min，优选大于20min，更优选大于30min；
132、(3)所述脂肪脱细胞基质冻干组合物能够通过27g的针头注射，优选能够通过30g的针头注射，更优选能够通过32g的针头注射；
133、(4)所述脂肪脱细胞基质冻干组合物的细胞增殖效果相比直接冻干的组合物的细胞增殖效果无明显区别，优选提高了10％。
134、在本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物的制备方法，所述方法包括步骤：
135、a、将脂肪脱细胞基质与助剂混合，得到调配的脂肪脱细胞基质乳液；
136、b、将调配的脂肪脱细胞基质乳液进行冻干，得到所述脂肪脱细胞基质冻干组合物；
137、其中，所述助剂包括助剂a和任选地助剂b；所述助剂a为糖类和多元醇，优选包括甘露醇、海藻糖、蔗糖中的一种或几种；所述助剂b包括甘油、聚乙二醇、聚乙烯醇、卡波姆、海藻酸钠、阿拉伯胶中的一种或几种。
138、在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物的用途，用于制备一医用材料或医疗美容材料，所述医用材料用于(1)软组织修复和/或(2)促进细胞增殖，所述医疗美容材料用于整形填充。
139、在另一优选例中，所述软组织修复包括促进脂肪细胞的增殖。
140、在另一优选例中，所述整形填充包括促进脂肪细胞的增殖。
141、在本发明的第四方面，提供了一种冻干粉剂，包括如本发明第一方面所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物。
142、在另一优选例中，所述冻干粉剂还包括药学上可接受的载体，例如冻干稳定剂、冻干保护剂等。
143、在另一优选例中，所述冻干粉剂在加入药学上可接受的缓冲液后可溶解成冻干针剂。
144、在另一优选例中，所述药学上可接受的缓冲液包括生理盐水、pbs、注射用水的一种或多种。
145、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述冻干组合物通过以下方法制备，所述方法包括步骤：
2.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中，所述脂肪脱细胞基质的浓度为0.1-40mg/ml，优选0.5-30mg/ml，更优选1-25mg/ml；
3.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，当所述调配的脂肪脱细胞基质乳液中不含有助剂b时，所述脂肪脱细胞基质的浓度为0.1-30mg/ml，优选0.5-25mg/ml，更优选1-20mg/ml。
4.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述脂肪脱细胞基质通过以下方法制备，所述方法包括：
5.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述脂肪脱细胞基质不含有细胞且不含有脂滴；
6.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述步骤a还包括：将脂肪脱细胞基质在水中物理破碎，得到脂肪脱细胞基质乳液，
7.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述步骤b中，冻干包括预冷冻、升华干燥和解析干燥。
8.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物，其特征在于，所述脂肪脱细胞基质冻干组合物具有选自下组的一个或多个特征：
9.如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
10.一种如权利要求1所述的脂肪脱细胞基质冻干组合物的用途，用于制备一医用材料或医疗美容材料，所述医用材料用于(1)软组织修复和/或(2)促进细胞增殖，所述医疗美容材料用于整形填充。
