本发明涉及生物，具体涉及一种突变酶组合物及其制备方法、试剂盒和应用。
背景技术：
1、在全球范围内每年因细菌、病毒、真菌等病原微生物感染给人类健康、畜牧、水产和食品等领域造成巨大损失。检测病原微生物的种类与数量，针对性开展病原微生物预防和治疗对于降低因感染而造成的损失具有重要的意义。目前检测病原微生物的方法包括传统培养法、核酸检测等。传统培养法需要分离、纯化微生物，再通过形态、生理等特征进行鉴别。该方法操作复杂、时间长，特别对形态、生理学特性接近的微生物难以准确区分。基于病原微生物特有的核酸片段进行检测是目前病原微生物检测的主要手段，主要包括普通pcr、实时荧光定量pcr、多重pcr、高通量测序等。这些方法准确度高、特异性强，但需要提取高纯度的基因组dna作为模板，再进行后续的核酸扩增，不仅耗时，而且依赖于昂贵的设备和专业的技术人员，不能满足需要快速、准确检测病原微生物的场景。
2、即时检验(point-of-care testing，poct)指现场快速检测，即在采样现场省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，利用便携式分析仪器、配套试剂等快速得到检测结果的一种检测方式。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)等恒温扩增技术只需恒温装置，操作简单、准确性高，是近年来发展迅速的poct技术。在水产养殖、肉类加工储存等场景，需要在现场对脂肪、蛋白含量高的肝脏、肌肉等样本进行破碎、裂解后，即采用lamp、rpa等恒温技术进行病原微生物快速检测。这些动物肝脏、肌肉组织等的裂解液中除了含有核酸外，脂肪、蛋白质等大分子和组织碎片对恒温扩增效率影响较大，而市售的基于这些技术的恒温扩增试剂盒需要纯度较高的dna或rna作为模板，难以直接用裂解液顺利完成病原微生物的现场检测。针对水产养殖、肉类加工储存等场景，亟需开发能用脂肪和蛋白含量高的样本的裂解液直接进行现场检测的恒温扩增试剂盒，这对于满足生产实际需求具有重要的意义。
技术实现思路
1、针对目前恒温检测试剂盒难以现场快速检测脂肪和蛋白含量高的样本的病原微生物的问题，本专利发明一种突变酶组合物及其制备方法，并提供了一种恒温扩增试剂盒及其应用。
2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
3、本发明提供一种用于恒温检测的突变酶组合物，包括质量比为2～4：1～1.5：2的突变酶uvsx-i113v、突变酶uvsy-t45s和突变蛋白gp32-d129e；
4、其中所述突变酶uvsx-i113v为来源于bacteriophage rb32的uvsx第113位异亮氨酸突变为缬氨酸突变的酶；
5、所述突变酶uvsy-t45s为来源于enterobacteria phage rb69的重组中介蛋白uvsy第45位苏氨酸突变为丝氨酸突变的酶；
6、所述突变蛋白gp32-d129e为大肠埃希菌(e.coli)的单链结合蛋白gp32的第129位天冬氨酸突变为谷氨酸突变的蛋白。
7、所述突变酶uvsx-i113v的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述突变酶uvsy-t45s的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述突变蛋白gp32-d129e的氨基酸序列如seq id no.8所示。
8、所述突变酶uvsx-i113v的氨基酸序列由核苷酸序列为seq id no.3dna分子编码获得；
9、所述突变酶uvsy-t45s的氨基酸序列由核苷酸序列为seq id no.6dna分子编码获得；
10、所述突变蛋白gp32-d129e的氨基酸序列由核苷酸序列为seq id no.9dna分子编码获得。
11、上述突变酶组合物的制备方法，包括：用t4连接酶分别将如seq id no.3、seq idno.6和seq id no.9所述的核苷酸序列连接至pet-28a载体，转化至e.coli dh5α细胞，iptg诱导，离心，超声破碎，离心亲和层析纯化，分别制备突变酶uvsx-i113v、突变酶uvsy-t45s和突变蛋白gp32-d129e；将获得的突变酶uvsx-i113v、突变酶uvsy-t45s和突变蛋白gp32-d129e以质量比为2～4：1～1.5：2混合。
12、所述突变酶uvsx-i113v制备中iptg诱导浓度为0.1mm，20℃诱导12h，所得突变酶uvsx-i113v浓度不低于0.95mg/ml；
13、所述突变酶uvsy-t45s制备中iptg诱导浓度为5mm，37℃诱导12h，所得突变酶uvsy-t45s浓度不低于0.60mg/ml；
14、所述突变蛋白gp32-d129e制备中iptg诱导浓度为1.0mm，37℃诱导12h，所得突变蛋白gp32-d129e浓度不低于0.90mg/ml。
15、本发明提供一种恒温核酸检测试剂盒，包括上述用于恒温检测的突变酶组合物。
16、所述恒温核酸检测试剂盒还包括裂解液、扩增试剂、阳性对照与阴性对照。
17、所述裂解液包括1mg/ml-20mg/ml蛋白酶k、0.5％-1％十二烷基二甲基苄基溴化铵和0.8mm-2mm nacl的混合溶液；
18、所述扩增试剂包括突变酶uvsx-i113v 120ng/μl、突变酶uvsy-t45s 30ng/μl、突变蛋白gp32-d129e 120ng/μl、bsu 30ng/μl、atp 1mm、dntp 200μm-300μm、乙酸镁14mm、氯化锌0.05mm和sybgreen，ph7.5；
19、所述阳性对照包括含有seq id no:12序列的puc57-rpod重组质粒5ng/μl、seq idno.10所示的正向引物、seq id no.11所示的反向引物；
20、所述阴性对照包括健康鲈鱼肝脏基因组dna 5ng/μl。
21、上述用于恒温核酸检测的突变酶组合物在高脂肪、高蛋白质含量的动物肝脏等组织或样品中快速检测病原微生物中的应用。
22、上述恒温核酸检测试剂盒在高脂肪、高蛋白质含量的动物肝脏等组织或样品快速检测病原微生物中的应用。
23、本发明提供一种恒温核酸检测方法，包括：待测样品加入裂解液磨碎，取上清，然后利用上述用于恒温检测的突变酶组合物或上述一种恒温核酸检测试剂盒，配制恒温核酸检测反应体系，恒温反应，并进行检测。
24、所述恒温反应的条件为：温度35～40℃，时间为15～20min；
25、所述检测中，反应后反应产物在蓝光灯下观察结果，若有荧光产生，表示阳性，无荧光产生，表示阴性。
26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27、本发明提供的用于恒温检测的突变酶组合物，包括突变酶uvsx-i113v、突变酶uvsy-t45s和突变蛋白gp32-d129e，均基于特定来源的酶/蛋白，通过特定的氨基酸位点突变，突变酶组合物显著提高了恒温扩增效率，该突变酶组合物制备方法简单、适用于批量化生产，大大降低了成本。
28、本发明提供的一种核酸检测试剂盒，包含该突变酶组合物为主要成分的扩增试剂、裂解液和对照，可直接用高脂肪、高蛋白质含量的样品的裂解液完成病原微生物的现场检测，满足现场快速检测的需求，具有广阔的应用前景。
29、本发明提供的恒温检测方法，通过使用阳性对照和阴性对照，该技术可以确保检测结果的准确性和可靠性。同时，荧光检测方法的引入，使得结果判断更加直观和准确，具有操作简单、设备需求低、反应周期短和适用于现场检测的特点，在35～40℃恒温条件下，15～20min便可完成扩增反应，克服了传统pcr方法价格高和lamp方法反应温度高的不足，在核酸检测领域具有广阔的应用前景，特别是在需要快速、准确结果的场合，本发明检测方法能提供及时、准确的检测结果。
1.一种用于恒温检测的突变酶组合物，其特征在于，包括质量比为2～4：1～1.5：2的突变酶uvsx-i113v、突变酶uvsy-t45s和突变蛋白gp32-d129e；
2.根据权利要求1所述的用于恒温检测的突变酶组合物，其特征在于，所述突变酶uvsx-i113v的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述突变酶uvsy-t45s的氨基酸序列如seqid no.5所示；所述突变蛋白gp32-d129e的氨基酸序列如seq id no.8所示。
3.根据权利要求2所述的用于恒温检测的突变酶组合物，其特征在于，
4.一种恒温核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述用于恒温检测的突变酶组合物。
5.根据权利要求4所述一种恒温核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括裂解液、扩增试剂、阳性对照与阴性对照。
6.根据权利要求5所述一种恒温核酸检测试剂盒，其特征在于，
7.一种如权利要求1～3任意一项所述用于恒温检测的突变酶组合物在高脂肪、高蛋白质含量的动物肝脏等组织或样品中快速检测病原微生物中的应用。
8.根据权利要求4所述的恒温核酸检测试剂盒在高脂肪、高蛋白质含量的动物肝脏等组织或样品中快速检测病原微生物中的应用。
9.一种恒温核酸检测方法，其特征在于，包括：待测样品加入裂解液磨碎，取上清，然后利用1～3任一项所述的用于恒温检测的突变酶组合物或权利要求6～8任一项所述一种恒温核酸检测试剂盒，配制恒温核酸检测反应体系，恒温反应，并进行检测。
10.根据权利要求9所述恒温核酸检测方法，其特征在于，所述恒温反应检测，反应产物在蓝光灯下观察结果，若有荧光产生，表示阳性，无荧光产生，表示阴性。
