本发明涉及单细胞测序，具体地，涉及一种分子标签组合及其在单细胞atac-seq中的应用。
背景技术：
1、染色质dna在行使转录等功能的生命活动中，需要将蛋白质剥离，使其处于相对裸露的状态，此时裸露的dna便于启动转录以调控基因的表达。这种允许启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子能够与染色质dna物理接触的程度就称为染色质可及性。
2、在全基因组层面对染色质可及性进行系统性的分析，可以破译基因转录调控中的功能性调控元件，为深入探究胚胎发育和肿瘤发生发展等生物学过程中的调控机制提供新的。atac-seq是一种目前应用最为广泛的在全基因组水平检测染色质可及性的测序技术。近几年来，随着微孔板、微流控和组合索引等单细胞标记技术的进步，各种scatac-seq技术如雨后春笋般涌现出来。虽然atac-seq等检测染色质开放性的技术已经被广泛地用于研究基因表达调控以及疾病的致病因素等中，但是在bulk水平的研究掩盖了细胞与细胞之间的异质性，极大地限制了其在研究复杂生物问题中的运用，如研究肿瘤微环境中各种免疫细胞的染色质可及性等。在2015年之后，多个课题组报道了一系列的在单细胞水平上研究染色质可及性的方法(scatac-seq)，依据目前scatac-seq标记单细胞的原理，可以将这些方法分为三大类，分别是：(1)基于微孔板的scatac-seq；(3)基于微流控平台的scatac-seq；(3)基于组合索引(combinatorial indexing)策略的scatac-seq。
3、以微孔板为基础的scatac-seq由于实验流程复杂度高或价格高昂的问题，目前很少有实验室继续使用。目前以微流控为基础的10x genomics公司的scatac-seq试剂盒由于商业化程度高，操作流程简单等原因普及度较高，应用较为广泛。虽然sci-atac-seq技术需要所在实验室自己制备96种带有barcode修饰的tn5转座体，这一步骤通常来说技术难度比较高，对于多数实验室而言比较困难。
4、由此可见，仍需要开发新的scatac-seq技术，以满足科研人员在各种复杂生物学问题上的应用。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种分子标签组合。根据本发明的实施方案，所述分子标签组合包括第一分子标签集，
3、所述第一分子标签集包括第一分子标签1和第一分子标签2，其中，所述第一分子标签1包括随机序列1和barcode1-1，所述第一分子标签2包括随机序列2和barcode1-2，其中，所述随机序列1的3’端与所述barcode1-1的5’端相连，所述随机序列2的3’端与所述barcode1-2的5’端相连，所述随机序列1和2均具有5’端磷酸化修饰。
4、组合索引在单细胞测序上的运用是通过split-pool的方式利用dna barcode的多次组合来原位(in situ)标记细胞。假设在split-pool的每次循环中都包含96种barcode序列(96孔板)，反复循环4次，理论上可以产生84,934,656(96的四次方)种组合，如此可以在一次实验中标记超过100万个单细胞。
5、根据本发明实施方案的所述分子标签组合通过四次反应添加至待测细胞的染色质开放区域，从而实现低成本、高通量的构建百万细胞的染色质开放性图谱。
6、根据本发明的实施方案，上述分子标签组合还可以进一步包括下列附加技术特征中的至少之一：
7、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集进一步包括序列1，所述序列1包括me1序列。
8、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1与序列1相连。
9、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集还包括序列2，所述序列2包括me2序列。
10、根据本发明的实施方案，所述序列1的至少部分和序列2的至少部分互补配对。
11、根据本发明的实施方案，所述me2序列具有5’端磷酸化修饰。
12、本领域技术人员可以理解，体外tn5实验，只需要核心序列(me：ctgtctcttatacacatct)、tn5转座酶以及mg2+就能够行使tn5的“剪切-复制”功能。
13、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1进一步与第一插入dna片段相连。
14、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1的3’端与所述me1序列的5’端相连，所述me1序列的3’端与所述插入dna片段的5’端相连，所述第一插入dna片段的3’端与所述me2序列的5’端相连。
15、根据本发明的实施方案，所述第一插入dna片段为细胞核中的开放染色质区域。本领域技术人员可以理解，在本技术中，所述第一插入dna片段来自待测细胞的细胞核，是本技术tbp进行转座反应时me序列可识别的开放染色质区域。
16、根据本发明的实施方案，所述随机序列1和2的至少一部分为随机合成的核酸序列，长度为10～18bp，优选为15bp。
17、根据本发明的实施方案，所述随机序列1包括：5’-aggccagagcattcg-3’(seq idno:1)。
18、根据本发明的实施方案，所述随机序列2包括：5’-catcggcgtacgact-3’(seq idno:2)。
19、需要说明的是，所述随机序列1和随机序列2的设置目的在于为下一轮添加分子标签提供可连接的核酸片段，比如，通过粘性末端连接，因此，本领域技术人员可以理解，所述随机序列1和2的核酸序列可以随意设置，只要设置的片段不显著影响整个测序过程中各反应步骤的效果和效率即可。
20、根据本发明的实施方案，所述barcode1-1和barcode1-2具有不同的核酸序列，所述barcode1-1和barcode1-2为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。需要说明的是，所述barcode1-1和barcode1-2的设置目的在于对待测样品进行分子标记，因此，本领域技术人员可以理解，barcode1-1和barcode1-2的种类可以根据待测样本的数量进行设置，只要设置的片段不显著影响整个测序过程中各反应步骤的效果和效率即可。
21、根据本发明的实施方案，所述me1和me2序列分别选自下列中的至少之一：
22、5’-ctgtctcttatacacatct-3’(seq id no:4)；和
23、5’-agatgtgtataagagacag-3’(seq id no:3)。
24、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集进一步序列3，所述序列3包括me3序列。
25、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签2与所述序列3相连。
26、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集还包括序列4，所述序列4包括me4序列。
27、根据本发明的实施方案，所述序列3的至少部分和序列4的至少部分互补配对。
28、根据本发明的实施方案，所述me4序列具有5’端磷酸化修饰。
29、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签2进一步与第二插入dna片段相连。
30、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签2的3’端与所述me3序列的5’端相连，所述me3序列的3’端与所述第二插入dna片段的5’端相连，所述第二插入dna片段的3’端与所述me4序列的5’端相连。
31、根据本发明的实施方案，所述序列1的至少部分和序列4的至少部分互补配对，所述序列2的至少部分和序列3的至少部分互补配对。
32、根据本发明的实施方案，所述第一插入dna片段的至少部分与所述第二插入片段的至少部分互补配对。本领域技术人员可以理解，所述第一插入dna片段与所述第二插入片段为同一个dna片段的沃森链和克里克链。
33、根据本发明的实施方案，所述第二插入dna片段为细胞核中的开放染色质区域。
34、根据本发明的实施方案，所述me3和me4序列分别选自下列中的至少之一：
35、5’-ctgtctcttatacacatct-3’(seq id no:6)；和
36、5’-agatgtgtataagagacag-3’(seq id no:5)。
37、根据本发明的实施方案，所述分子标签组合进一步包括第二分子标签，
38、所述第二分子标签包括i5接头序列和barcode2。需要注意的是，所述i5接头序列可以适配最后一轮pcr反应中truseq建库的i5端引物，以构建符合illumina测序的文库结构。
39、根据本发明的实施方案，所述第二分子标签的3’端与所述第一分子标签1的5’端相连。
40、根据本发明的实施方案，所述第二分子标签还包括连接序列2。
41、根据本发明的实施方案，所述barcode2的3’端与所述连接序列2的5’端相连，所述barcode2的5’端与所述i5接头序列的3’端相连。
42、根据本发明的实施方案，所述i5接头序列的至少一部分为随机合成的核酸序列，其长度为15～25bp，优选为18bp。
43、根据本发明的实施方案，所述i5接头序列包括：5’-acgacgctcttccgatct-3’(seqid no:7)。
44、根据本发明的实施方案，所述barcode2为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
45、根据本发明的实施方案，所述连接序列2的至少一部分为随机合成的核酸序列，所述连接序列2的长度为13～25bp。
46、根据本发明的实施方案，所述连接序列2是通过粘性末端连接所述barcode2和所述第一分子标签1。
47、根据本发明的实施方案，所述连接序列2包括5’-atccacgtgcttgag-3’(seq idno:9)。
48、根据本发明的实施方案，所述分子标签组合还包括第三分子标签，所述第三分子标签包括i7接头序列和barcode3。i7接头序列可以适配最后一轮pcr反应中nextera建库的i7端引物，以构建符合illumina测序的文库结构。
49、根据本发明的实施方案，所述第三分子标签的3’端与所述第一分子标签2的5’端相连。
50、根据本发明的实施方案，所述第三分子标签还包括连接序列3。
51、根据本发明的实施方案，所述barcode3的3’端与所述随机序列2的5’端相连，所述barcode3的5’端与所述i7接头序列的3’端相连。
52、根据本发明的实施方案，所述i7接头序列的至少一部分为随机合成的核酸序列，其长度为28～38bp，优选为34bp。
53、根据本发明的实施方案，所述barcode3为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
54、根据本发明的实施方案，所述连接序列3包括所述barcode3的互补核酸序列、互补序列1和互补序列2，其中，所述互补序列1与所述随机序列2的5’端序列部分互补，所述互补序列2与所述i7接头序列的3’端序列部分互补。此处通过使用粘性末端将barcode3和所述随机序列2进行连接。
55、根据本发明的实施方案，所述互补序列1的5’端与所述barcode3的互补核酸序列的3’端相连，所述barcode3的互补核酸序列的5’端与所述互补序列2的3’端相连。
56、根据本发明的实施方案，所述连接序列3的长度为13～25bp，在本发明的具体实施方案中，所述连接序列3的长度为19bp。
57、根据本发明的实施方案，所述i7接头序列包括：
58、5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’(seq id no:10)。
59、根据本发明的实施方案，所述互补序列1包括：5’-gtagccgc-3’(seq id no:11)。
60、根据本发明的实施方案，所述互补序列2包括：5’-ctctgtc-3’(seq id no:12)。
61、根据本发明的实施方案，包括第四分子标签集，所述第四分子标签集包括第四分子标签1和第四分子标签2，所述第四分子标签1包括p5序列和barcode4-1，所述第四分子标签2包括p7序列和barcode4-2。
62、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签1还包括连接序列4。
63、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签1的3’端与所述第二分子标签的5’端相连，所述第四分子标签2的5’端与所述第三分子标签的3’端相连。
64、根据本发明的实施方案，所述p5序列的3’端与所述barcode4-1的5’端相连，所述barcode4-1的3’端与所述连接序列4的5’端相连，所述连接序列4的3’端与所述i5接头序列的5’端相连，所述p7序列的5’端与所述barcode4-2的3’端相连，所述barcode4-2的5’端与所述i7接头序列的3’端相连。
65、根据本发明的实施方案，所述p5序列包括：5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacac-3’(seq id no:28)。
66、根据本发明的实施方案，所述p7序列包括：5’-tagagcatacggcagaagacgaac-3’(seq id no:29)。
67、根据本发明的实施方案，所述barcode4为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
68、根据本发明的实施方案，所述连接序列4的至少一部分为随机合成的核酸序列，其长度为10～20bp，优选为15bp。
69、根据本发明的实施方案，所述连接序列4包括：5’-acactctttccctac-3’(seq idno:30)。
70、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签1中还包括pcr引物1，所述pcr引物1的结合区包括：5’-acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seq id no:13)。
71、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签2中还包括pcr引物2，所述pcr引物2的结合区包括：5’-gtctcgtgggctcgg-3’(seq id no:14)。
72、在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒，所述试剂盒用于单细胞测序和/或染色质可及性检测。根据本发明的实施方案，所述试剂盒包括第一方面所述的分子标签组合，所述分子标签组合不包括所述插入dna片段。根据本发明实施方案的试剂盒成本低，且能够有效构建通量达到百万细胞的单细胞染色质可及性测序文库，其中，所述插入dna片段来自于待测的细胞核，因此，不包括在试剂盒内。
73、根据本发明的实施方案，上述试剂盒还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
74、根据本发明的实施方案，所述试剂盒还包括细胞核提取试剂、细胞核固定试剂、转座反应试剂、核酸连接试剂、pcr反应试剂和核酸纯化试剂中的至少之一。
75、根据本发明的实施方案，所述细胞核提取试剂包括下列中的至少之一：细胞裂解液和nwb缓冲液。
76、根据本发明的实施方案，所述细胞核固定试剂包括下列中的至少之一：甲醛、甘氨酸和pbs。
77、根据本发明的实施方案，所述转座反应试剂包括下列中的至少之一：tn5转座酶、mgcl2和dmf。
78、根据本发明的实施方案，所述核酸连接试剂包括下列中的至少之一：t4 ligationbuffer、t4 dna ligase、t7 ligation buffer、t7 dna ligase、triton-x 100和nwb缓冲液。
79、根据本发明的实施方案，所述pcr反应试剂包括下列中的至少之一：sds、蛋白酶k、triton-x 100和高保真dna聚合酶。
80、根据本发明的实施方案，所述核酸纯化试剂包括下列中的至少之一：dna纯化磁珠和乙醇。
81、本领域技术人员可以理解，所述试剂盒中可以包括任何能够进行染色质可及性检测和、或单细胞测序的相关试剂。
82、在本发明的第三方面，本发明提出了一种高通量单细胞测序文库的构建方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：
83、1)用tbp对细胞核进行转座反应，以获得转座后的待测序列。
84、2)收集所述待测序列，与第二分子标签进行第二轮连接反应。
85、3)收集所述第二轮连接反应的产物，与第三分子标签进行第三轮连接反应。
86、4)收集所述第三轮连接反应的产物，通过pcr技术引入第四分子标签集。
87、其中，所述tbp包括第一分子标签集，
88、所述第一分子标签集包括第一分子标签1和第一分子标签2，其中，所述第一分子标签1包括随机序列1和barcode1-1，所述第一分子标签2包括随机序列2和barcode1-2，其中，所述随机序列1的3’端与所述barcode1-1的5’端相连，所述随机序列2的3’端与所述barcode1-2的5’端相连，所述随机序列1和2均具有5’端磷酸化修饰。根据本发明实施方案的单细胞测序文库的构建方法不仅成本低，且通量远高于现有技术，能够达到百万细胞。
89、根据本发明的实施方案，上述方法还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
90、根据本发明的实施方案，tpb包括tn5转座酶、所述第一分子标签1和第一分子标签2。
91、根据本发明的实施方案，tpb是在自组装体系中组装的，所述自组装体系中，tn5转座酶、所述第一分子标签1和第一分子标签2的摩尔比为(0.8～1)：(0.8～1)：(0.8～1)。
92、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1的种类至少为8种，所述第一分子标签2的种类至少为12种。
93、根据本发明的实施方案，所述自组装体系如表4所示。
94、根据本发明的实施方案，所述组装是在25℃～30℃条件下300～400rpm震荡进行30～60min。
95、根据本发明的实施方案，所述组装是在25℃条件下400rpm震荡进行30～60min。
96、根据本发明的实施方案，所述转座反应是在转座体系中进行的，所述转座体系中5×lm、1％digitonin、1％np-40的终浓度为1、0.01％和0.1-0.5％，细胞核的数量为10000～50000。根据本发明的具体实施方案，进行转座反应使用的细胞核的数量为10000～50000时，利用本技术的方法能够轻松构建细胞染色质可及性测序文库。
97、根据本发明的实施方案，所述转座是在包括表6所示的反应体系下进行的。
98、根据本发明的实施方案，所述转座反应是在37℃条件下400rpm震荡进行60min。
99、根据本发明的实施方案，所述tbp至少为12、24、48、96、348或1536种，且每种所述tpb中包括的第一分子标签集不同。
100、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集进一步包括序列1，所述序列1包括me1序列。
101、根据本发明的实施方案，在所述待测序列中所述第一分子标签1与序列1和序列2相连，其中，所述序列1和序列2分别独立地选自me1序列和me2序列，且序列1的至少部分和序列2的至少部分互补配对。
102、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1进一步与第一插入dna片段相连。
103、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签1的3’端与所述me1序列的5’端相连，所述me1序列的3’端与所述第一插入dna片段的5’端相连，所述第一插入dna片段的3’端与所述me2序列的5’端相连。
104、根据本发明的实施方案，所述第一插入dna片段为细胞核中的开放染色质区域。
105、根据本发明的实施方案，所述随机序列1和2的至少一部分为随机合成的核酸序列，长度为10～18bp，优选为15bp。
106、根据本发明的实施方案，所述随机序列1包括：5’-aggccagagcattcg-3’(seq idno:15)。
107、根据本发明的实施方案，所述随机序列2包括：5’-catcggcgtacgact-3’(seq idno:16)。
108、根据本发明的实施方案，所述barcode1-1和barcode1-2具有不同的核酸序列，所述barcode1-1和barcode1-2为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
109、根据本发明的实施方案，所述me1和me2序列分别选自下列中的至少之一：
110、5’-ctgtctcttatacacatct-3’(seq id no:18)；和
111、5’-agatgtgtataagagacag-3’(seq id no:17)。
112、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集进一步包括序列3，所述序列3包括me3序列。
113、根据本发明的实施方案，在所述待测序列中所述第一分子标签2与序列3相连。
114、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签集还包括序列4，所述序列4包括me4序列。
115、根据本发明的实施方案，所述序列3的至少部分和所述序列4的至少部分反向互补配对。
116、根据本发明的实施方案，所述me4序列具有5’端磷酸化修饰。
117、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签2进一步与第二插入dna片段相连。
118、根据本发明的实施方案，所述第一分子标签2的3’端与所述me3序列的5’端相连，所述me3序列的3’端与所述第二插入dna片段的5’端相连，所述第二插入dna片段的3’端与所述me4序列的5’端相连。
119、根据本发明的实施方案，所述序列1的至少部分和序列4的至少部分互补配对，所述序列2的至少部分和序列3的至少部分互补配对。
120、根据本发明的实施方案，所述第一插入dna片段的至少部分与所述第二插入片段的至少部分互补配对。
121、根据本发明的实施方案，所述第二插入dna片段为细胞核中的开放染色质区域。
122、根据本发明的实施方案，所述me3和me4序列分别选自下列中的至少之一：
123、5’-ctgtctcttatacacatct-3’(seq id no:20)；和
124、5’-agatgtgtataagagacag-3’(seq id no:19)。
125、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应和第三轮连接反应是在连接反应体系中进行的，所述连接反应体系中10×t4 ligation buffer、t4 dna ligase、10％triton-x 100的终浓度为1、10～20个活性单元、0.01～0.05％。
126、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应体系中所述第二分子标签的终浓度为5μm。
127、根据本发明的实施方案，所述第三轮连接反应体系中所述第三分子标签的终浓度为5μm。
128、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应体系中所含细胞量为1万-5万个。
129、根据本发明的实施方案，所述第三轮连接反应体系中所含细胞量为1万-5万个。
130、根据本发明的一些具体的实施例，当细胞数量为1万～5万个范围内，所述方法均能够有效的构建单细胞测序文库。
131、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应和第三轮连接反应是在包括表7所示的反应体系中进行的。
132、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应是在37℃下400rpm震荡进行30min，所述第三轮连接反应在37℃下400rpm震荡进行30min。
133、根据本发明的实施方案，所述第二轮连接反应和第三轮连接反应中，所述第二分子标签和第三分子标签的种类均至少包括96种。
134、根据本发明的实施方案，所述第二分子标签包括i5接头序列和barcode2。
135、根据本发明的实施方案，在所述第二轮连接反应的产物中所述第二分子标签的3’端与所述第一分子标签1的5’端相连。
136、根据本发明的实施方案，所述第二分子标签还包括连接序列2。
137、根据本发明的实施方案，所述barcode2的3’端与所述连接序列2的5’端相连，所述barcode2的5’端与所述i5接头序列的3’端相连。
138、根据本发明的实施方案，所述i5接头序列的至少一部分为随机合成的核酸序列，其长度为15～33bp，优选为18bp。本领域技术人员可以理解，所述i5接头序列至少部分为truseq read1测序接头序列。
139、根据本发明的实施方案，所述i5接头序列包括：5’-acgacgctcttccgatct-3’(seqid no:21)。
140、根据本发明的实施方案，所述barcode2为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
141、根据本发明的实施方案，所述连接序列2的至少一部分为随机合成的核酸序列，所述连接序列2的单条链的长度为13～25bp。
142、根据本发明的实施方案，所述连接序列2是通过粘性末端连接barcode2和所述第一分子标签1。
143、根据本发明的实施方案，所述连接序列2包括5’-atccacgtgcttgag-3’(seq idno:22)。
144、根据本发明的实施方案，所述第三分子标签包括i7接头序列和barcode3。
145、根据本发明的实施方案，在所述第三轮反应的产物中，所述第三分子标签的3’端与所述第一分子标签2的5’端相连。
146、根据本发明的实施方案，所述第三分子标签还包括连接序列3。
147、根据本发明的实施方案，所述barcode3的3’端与所述随机序列2的5’端相连，所述barcode3的5’端与所述i7接头序列的3’端相连。
148、根据本发明的实施方案，所述i7接头序列的至少一部分为随机合成的核酸序列，其长度为15～34bp，优选为15bp。所述述i7接头序列的至少一部分为nextera read2测序引物。
149、根据本发明的实施方案，所述barcode3为5’-nnnnnnnn-3’(seq id no:8)，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
150、根据本发明的实施方案，所述连接序列3包括所述barcode3的互补核酸序列、互补序列1和互补序列2，其中，所述互补序列1与所述随机序列2的5’端序列部分互补，所述互补序列2与所述i7接头序列的3’端序列部分互补。
151、根据本发明的实施方案，所述互补序列1的5’端与所述barcode3的互补核酸序列的3’端相连，所述barcode3的互补核酸序列的5’端与所述互补序列2的3’端相连。
152、根据本发明的实施方案，所述连接序列3的长度为13～25bp，优选为19bp。
153、根据本发明的实施方案，所述i7接头序列包括：
154、5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’(seq id no:23)。
155、根据本发明的实施方案，所述互补序列1包括：5’-gtagccgc-3’(seq id no:24)。
156、根据本发明的实施方案，所述互补序列2包括：5’-ctctgtc-3’(seq id no:25)。
157、根据本发明的实施方案，所述pcr反应体系中，所述第三连接反应产物的细胞数为5,000～20,000，所述第四分子标签1和第四分子标签2的摩尔比为(0.8～1)：(0.8～1)。根据本发明的具体实施例，所述第四分子标签1和第四分子标签2的终浓度均为0.5μm。
158、根据本发明的实施方案，所述pcr的是在包括如表8所示的反应体系下进行的。
159、根据本发明的实施方案，所述pcr的反应程序为：72℃进行5～10min，1个循环；98℃进行1min，1个循环；98℃进行20s，59℃进行30s，72℃进行30s，12个循环；72℃进行5min，1个循环。
160、根据本发明的实施方案，所述pcr的反应程序如表9所示。
161、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签集包括第四分子标签1和第四分子标签2。
162、根据本发明的实施方案，在所述pcr反应产物中，所述第四分子标签1的3’端与所述第二分子标签的5’端相连，所述第四分子标签2的5’端与所述第三分子标签的3’端相连。
163、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签1包括p5序列和barcode4-1，所述第四分子标签2包括p7序列和barcode4-2。
164、根据本发明的实施方案，所述第四分子标签1还包括连接序列4。
165、根据本发明的实施方案，所述p5序列的3’端与所述barcode4-1的5’端相连，所述barcode4-1的3’端与所述连接序列4的5’端相连，所述连接序列4的3’端与所述i5接头序列的5’端相连，所述p7序列的5’端与所述barcode4-2的3’端相连，所述barcode4-2的5’端与所述i7接头序列的3’端相连。
166、根据本发明的实施方案，所述p5序列包括：5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacac-3’(seq id no:28)。
167、根据本发明的实施方案，所述p7序列包括：5’-tagagcatacggcagaagacgaac-3’(seq id no:29)。
168、根据本发明的实施方案，所述barcode4为5’-nnnnnnnn-3’，其中，n表示a、t、c、g中的任一种。
169、根据本发明的实施方案，所述连接序列4包括：5’-acactctttccc-3’。
170、根据本发明的实施方案，所述pcr反应中，pcr引物1的结合区包括：5’-acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’(seq id no:26)，pcr引物2的结合区包括：5’-gtctcgtgggctcgg-3’(seq id no:27)。
171、根据本发明的实施方案，所述方法还包括对所述pcr反应产物进行纯化处理。
172、根据本发明的实施方案，所述纯化处理包括磁珠纯化。
173、在本发明的第四方面，本发明提出了一种检测细胞染色质可及性的方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：
174、a)利用第三方面所述的方法对待测细胞样本的细胞核构建单细胞测序文库。
175、b)对所述单细胞测序文库进行测序，以获得单细胞测序数据；
176、c)基于所述单细胞测序数据确定所述细胞染色质的可及性。
177、根据本发明的实施方案，上述检测细胞染色质可及性的方法还可以包括下列附加技术中的至少之一：
178、根据本发明的实施方案，所述细胞包括脊椎动物细胞和植物细胞中的至少之一。
179、根据本发明的实施方案，在进行步骤c)之前，预先对所述单细胞测序数据进行质控分析和预处理。
180、在本发明的第五方面，本发明提出了一种高通量单细胞测序方法。根据本发明的实施方案，所述方法包括：
181、a)利用第三方面所述的方法对待测细胞样本的细胞核构建单细胞测序文库；
182、b)对所述单细胞测序文库进行测序，以获得单细胞测序数据；
183、c)基于所述单细胞测序数据与参考数据的对比结果，确定所述细胞的种类。
184、根据本发明的实施方案，上述高通量单细胞测序方法还可以包括下列附加技术中的至少之一：
185、根据本发明的实施方案，所述参考数据包括下列中的至少之一：基因组元件百科全书计划中的染色质可及性参考数据。本领域技术人员可以理解，所述参考数据文库可以为任何本领域权威、可靠的染色质可及性参考数据。
186、根据本发明的实施方案，所述细胞包括脊椎动物细胞和植物细胞中的至少之一。
187、本发明包括如下有益效果中的至少之一：
188、(1)本技术所述的分子标签组合通过四次反应连接至待检测的细胞核中的染色质开放区域，能够有效的对所述细胞的染色质开放性进行检测，从而对单细胞的种类进行识别；
189、(2)本技术所述的单细胞测序方法的成本和通量远低于现有技术，能够构建100万个细胞的染色质可及性图谱。
190、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
1.一种分子标签组合，其特征在于，包括第一分子标签集，
2.根据权利要求1所述的分子标签组合，其特征在于，所述第一分子标签集进一步包括序列1，所述序列1包括me1序列；
3.根据权利要求2所述的分子标签组合，其特征在于，所述第一分子标签集进一步包括序列3，所述序列3包括me3序列；
4.根据权利要求1所述的分子标签组合，其特征在于，进一步包括第二分子标签，
5.根据权利要求4所述的分子标签组合，其特征在于，还包括第三分子标签，所述第三分子标签包括i7接头序列和barcode3；
6.根据权利要求5所述的分子标签组合，其特征在于，包括第四分子标签集，所述第四分子标签集包括第四分子标签1和第四分子标签2，所述第四分子标签1包括p5序列和barcode4-1，所述第四分子标签2包括p7序列和barcode4-2；
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的分子标签组合，所述分子标签组合不包括所述插入dna片段。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞核提取试剂、细胞核固定试剂、转座反应试剂、核酸连接试剂、pcr反应试剂和核酸纯化试剂中的至少之一；
9.一种高通量单细胞测序文库的构建方法，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，tpb包括tn5转座酶、所述第一分子标签1和第一分子标签2；
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一分子标签集进一步包括序列3，所述序列3包括me3序列；
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二轮连接反应和第三轮连接反应是在连接反应体系中进行的，所述连接反应体系中10×t4 ligation buffer、t4 dnaligase、10％triton-x 100的终浓度为1、10～20个活性单元、0.01～0.05％；
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第三分子标签包括i7接头序列和barcode3；
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述pcr反应体系中，所述第三连接反应产物的细胞数为5,000～20,000，所述第四分子标签1和第四分子标签2的终浓度为0.5μm；
15.一种检测细胞染色质可及性的方法，其特征在于，包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞包括脊椎动物细胞和植物细胞中的至少之一；
17.一种高通量单细胞测序方法，其特征在于，包括：
18.根据权利要求17所述的测序方法，其特征在于，所述参考数据包括下列中的至少之一：基因组元件百科全书计划中的染色质可及性参考数据；
