本发明属于分析检测，具体涉及一种同时检测血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的方法，。
背景技术：
1、液质联用，简称lc-ms/ms，指的是液相色谱与质谱联用技术。它结合了液相色谱仪其有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力，又具备质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。它的分离系统为液相色谱，检测系统为质谱平台。样品在色谱部分在流动相和色谱柱的作用下分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。随着离子化技术和质量分析器的不断进步，液相色谱串联质谱在药物分析、食品分析、环境分析、毒物筛查、临床检验等许多领域已经得到了广泛的应用。lc-ms/ms检测具有高选择性和高灵敏度，已应用于大多数有机化合物的检测，15(s)-hpete可检测物质从小分子药物、代谢物到大分子蛋白质等。在临床应用越来越广泛，可以检测多种传统手段无法实现检测的标志物，目前此技术已在临床上用于检测激素、胆汁酸、长链脂肪酸、维生素、儿茶酚胺及其体内代谢产物等多种小分子物质，可更好地助力临床精准诊断和治疗。
2、棕榈酸(palmitic acid,pa)，化学式：c16h32o2；15(s)-过氧氢二十碳四烯酸(15(s)-hydrogen peroxide eicosatetraenoic acid,15(s)-hpete),化学式：c20h32o4；十六烷基二酸(hexadecanedioic acid,hda)，化学式：c16h30o4；16-羟基十六烷酸(16-hydroxyhexadecanoic acid,16oh-ha)，化学式：c16h32o3。pa、15(s)-hpete、hda和16oh-ha都属于长链脂肪酸家族。有大量研究证实当肝脏脂质代谢平衡紊乱时，肝脏脂质开始积累，炎症和纤维化途径的长期激活可能会导致肝脏疾病恶化。而酒精会导致肝脏脂质代谢失调，诱导肝脏脂肪酸摄取、氧化受阻。有研究发现，棕榈酸pa可以诱导细胞分泌肿瘤坏死因子(tnf)，产生促炎微环境，抑制脂肪酸代谢和氧化磷酸化，促进脂肪肝形成。15(s)-hpete可以通过诱导内皮细胞凋亡，在脂肪组织的基质血管部分中产生抗血管生成作用，还可以通过调节bcl-2家族蛋白的表达来诱导癌细胞凋亡进而发挥抗肿瘤活性。十六烷基二酸hda存在于肝脏线粒体中，肝细胞中atp的主要部分是在线粒体中形成的，而hda能够在没有atp合成的情况下刺激琥珀酸盐燃料肝线粒体的呼吸。目前已有研究表明hda可以作为评估由肝脏药物转运蛋白介导的药物相互作用的潜在生物标志物。而16oh-ha已被证实也存在于肝微粒体中，但其机制未知，迫切的需要我们未来进一步的去探索。
3、我们通过非靶向代谢组学的方法，发现pa、15(s)-hpete、hda和16oh-ha在酒精性肝病患者中明显失调，因而考虑pa、15(s)-hpete、hda和16oh-ha的精准定量对酒精性肝病患者的诊断具有极其重要的潜在临床意义。因此，本发明建立了一种基于液相色谱串联质谱技术的血清pa、15(s)-hpete、hda和16oh-ha的检测分析方法，血清样本通过蛋白沉淀前处理后，通过液相色谱串联质谱平台实现对血清水平的精准检测。我们进一步通过lc-ms/ms的方法靶向分析发现pa、hda和16oh-ha在酒精性肝病的患者中表达水平明显增加，而15(s)-hpete表达水平明显降低。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种同时检测血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的方法，可以快速、准确地检测出血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的含量。
2、本发明所提供的同时检测血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的方法，包括如下步骤：
3、s1、待测样本经前处理，得到上清液；所述待测样本为血清；
4、s2、将所述上清液进行液相色谱串联质谱检测；
5、所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：
6、0～2.10min，流动相a的体积含量由40％调节至30％，流动相b的体积含量由60％调节至70％；
7、2.10～2.12min，流动相a的体积含量由30％调节至29％，流动相b的体积含量由70％调节至71％；
8、2.12～4.00min，流动相a的体积含量由29％调节至20％，流动相b的体积含量由71％调节至80％；
9、4.00～4.10min，流动相a的体积含量由20％调节至2％，流动相b的体积含量由80％调节至98％；
10、4.10～5.10min，流动相a的体积含量由2％调节至40％，流动相b的体积含量由98％调节至60％；
11、5.10～7.00min，流动相a的体积含量保持为40％，流动相b的体积含量保持为60％；
12、所述流动相a为10mm的乙酸铵水溶液，流动相b为异丙醇：乙腈＝1：1(v/v)的混合溶液，内含5mm乙酸铵。
13、所述液相色谱串联质谱检测的质谱条件如下：
14、离子源为电喷雾离子源(esi)；扫描方式为smrm；离子喷雾电压为-4500v，温度为500℃，雾化气为50psi，辅助加热气为50psi，气帘气为25psi，碰撞气为7psi。
15、本发明提供的检测方法中，所述前处理的步骤如下：
16、将所述待测样本与内标物质(pa-d13、15-hete-d8和hda-d28)进行混合，再加入沉淀剂(100％异丙醇)，然后进行涡旋并离心，所得的上清液转移至96孔板中。
17、所述pa-d13为棕榈酸-d13(cas号：2692623-91-7)，所述15-hete-d8为15-过氧氢二十碳四烯酸-d8(cas号：84807-87-4)，所述hda-d28为十六烷基二酸-d28(cas号：130348-90-2)。
18、所述pa-d13为pa的内标物质，15-hete-d8为15(s)-hpete和16oh-ha的内标物质，hda-d28为hda的内标物质。
19、根据本发明的实施例，上述前处理中，所述待测样本、内标物质溶液、沉淀剂异丙醇的体积比可为100:10:400。所述内标物质溶液中pa-d13的终浓度为20μg/ml，15-hete-d8的终浓度为5μg/ml，hda-d28的终浓度为1μg/ml。
20、根据本发明的实施例，上述前处理中，所述离心的条件为：14000rpm离心10min。
21、本发明检测方法中，所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：
22、色谱柱为xbridge beh c18(2.1mm×100mm,3.5μm，waters)色谱柱
23、柱温为45℃；进样体积为5μl；进样器温度为8℃。
24、进一步的，所述方法还包括对待测样本中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸进行定量的步骤，具体如下：
25、a)标准曲线的制备：在1％bsa溶液中分别加入系列浓度的各待测物的标准品，按照所述s1中前处理方法进行处理；将获得的各待测物的系列标准样品采用所述s2中液相色谱串联质谱进行检测；以系列标准样品中各标准品与对应内标物的峰面积比值为纵坐标，相应标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线；
26、b)将所述s2中测定得到的待测样本中各待测物与对应内标物的峰面积比值代入步骤a)得到的各待测物对应的标准曲线中，计算得出所述待测样本中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的含量。
27、上述方法步骤a)中，所述系列浓度至少包括5个浓度；hda的浓度范围为0.2-800ng/ml，16oh-ha的浓度范围为10-800ng/ml；15(s)-hpete的浓度范围为10-4000ng/ml；pa的浓度范围为50-20000ng/ml。
28、本发明还保护一种对血清样本进行测定的系统在制备同时检测棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的产品中的应用。
29、所述对血清样本进行测定的系统包括采用本发明所述方法对血清样本进行预处理和采用液相色谱串联质谱检测时所需的各种试剂和/或仪器。
30、进一步的，所述对血清样本进行预处理时所需的各种试剂和/或仪器中，所述试剂包括：所述内标物质、异丙醇；所述仪器包括：混合设备、离心设备；
31、所述采用液相色谱串联质谱检测时所需的各种试剂和/或仪器中，所述试剂包括：所述流动相a、所述流动相b；所述仪器包括：液相色谱串联质谱仪、所述色谱柱。
32、本发明利用液相色谱的高分离性能，以及质谱的高选择性和高灵敏度，能够精准地检测血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的水平，为酒精性肝病的诊断提供指导和帮助。
1.一种同时检测血清中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：色谱柱为xbridge beh c18(3.5μm,2.1mm*100mm,waters)色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱串联质谱检测的液相条件如下：
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱串联质谱检测的质谱条件如下：离子源为电喷雾离子源(esi)；扫描方式为smrm；离子喷雾电压为-4500v，温度为500℃，雾化气为50psi，辅助加热气为50psi，气帘气为25psi，碰撞气为7psi。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述前处理的步骤如下：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述前处理中，所述待测样本、内标物质溶液、沉淀剂的体积比为100:10:400；所述内标物质溶液中pa-d13的终浓度为20μg/ml，15-hete-d8的终浓度为5μg/ml，hda-d28的终浓度为1μg/ml。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对待测样本中棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸进行定量的步骤，具体如下：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤a)中，所述系列浓度至少包括5个浓度；所述系列浓度的十六烷基二酸的浓度范围为0.2-800ng/ml，所述系列浓度的16-羟基十六烷酸的浓度范围为10-800ng/ml；所述系列浓度的15(s)-过氧氢二十碳四烯酸的浓度范围为10-4000ng/ml；所述系列浓度的棕榈酸的浓度范围为50-20000ng/ml。
9.一种对血清样本进行测定的系统在制备同时检测棕榈酸、15(s)-过氧氢二十碳四烯酸、十六烷基二酸和16-羟基十六烷酸的产品中的应用；
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述对血清样本进行预处理时所需的各种试剂和/或仪器中，所述试剂包括：所述内标物质、异丙醇；所述仪器包括：混合设备、离心设备；
