本发明涉及生物分析检测相关，尤其是涉及一种检测生物基质中炔雌醇浓度的方法及试剂盒。
背景技术：
1、炔雌醇作为一种具有显著生物活性的化合物，其在生物医药检测领域中的应用尤为关键。炔雌醇对下丘脑和垂体功能具有显著的双向调节作用，具体表现为：小剂量炔雌醇能够刺激促性腺激素的分泌，促进内分泌系统的正常运作；而大剂量炔雌醇则通过抑制促性腺激素的分泌，进一步抑制卵巢排卵过程，从而达到抗生育的效应。在给药方式上，炔雌醇通过口服途径给药后，可迅速被胃肠道吸收进入血液循环。进入血液后，炔雌醇能够与血浆蛋白发生中度结合，进而在肝脏内进行代谢。值得注意的是，炔雌醇在体内的代谢途径主要以原形排出，其中约60％的炔雌醇通过尿液排出体外。
2、炔雌醇的适应症广泛，主要包括：补充雌激素不足，治疗女性性腺功能不良、闭经、更年期综合征等疾病；用于治疗晚期乳腺癌(特别是绝经期后妇女)和晚期前列腺癌；与孕激素类药物联合使用，通过抑制排卵，作为避孕药使用；此外，还用于小儿隐睾症、雄激素过多、垂体肿瘤等多种疾病的辅助治疗。同时，炔雌醇还可用于治疗由促性腺激素分泌不足引起的性腺功能低下、闭经、不育症以及多滤泡卵巢导致的不育症等。
3、鉴于炔雌醇在临床上的广泛应用，其血药浓度的监测显得尤为重要。然而，由于炔雌醇的临床给药量极小(通常为35μg/片/天)，导致血浆中炔雌醇的浓度极低，据文献报道，其平均最高血药浓度仅为约90pg·ml-1。这一特点使得炔雌醇的检测过程变得尤为复杂和敏感。相关技术中最低检测限水平仅达0.3nm，换算为质量浓度则高达88.92pg/ml，这显然不利于炔雌醇的血药浓度监测。
4、因此，开发一种检测灵敏度更高的生物基质中炔雌醇的检测方法及试剂盒具有重要的临床和科研价值。这样的方法将能够更准确地监测患者体内的炔雌醇浓度，为临床治疗和药物研究提供有力的支持。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测生物基质中炔雌醇的方法，该方法检测灵敏度高。
2、本发明还提出用于实现上述方法的检测试剂盒。
3、根据本发明的一个方面，提出了一种检测生物基质中炔雌醇的方法，包括如下步骤：取经预处理后的生物基质，采用液相色谱-质谱联用仪进行检测；
4、其中，检测过程中包括如下条件：流动相a相：ph在7～8之间的碱性盐水溶液，流动相b相为甲醇与乙腈的混合溶液，所述混合溶液中甲醇体积占比为45～55％，检测过程中采用梯度洗脱，流动相b相的体积占比在75％～95％之间变化。
5、根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案采用碱性流动相体系获得更好的测物响应，使得本发明方案的检测灵敏度优于相关技术，此外，在碱性流动相体系下，血浆中内源性物质在色谱柱中的保留性质发生了改变，而炔雌醇受酸碱性的影响相对较小，从而让干扰物质和炔雌醇之间获得更好的分离效果，由此实现待测物出峰位置基线无明显升高，且无干扰峰影响。传统检测方法中通常采用酸性流动相体系，而本发明方案意外发现炔雌醇检测在碱性流动相体系中的测物响应更佳，不仅分离效果更佳，检测灵敏度更高，同时，还可实现更低样本量的检测，生物基质样品量相较于传统检测方法减少50％以上，仅需200μl血浆样品，大大降低了所需样本量，为实现准确可靠监测血药浓度提供了新的方向。本发明方案在药物临床试验中，由于涉及的样本量巨大，繁琐的检测过程不仅影响了样本的检测效率，还提高了检测成本。
6、在本发明的一些实施方式中，所述碱性盐为水溶液呈碱性的可挥发性盐。如碳酸氢铵和碳酸铵等。
7、在本发明的一些实施方式中，检测过程中的流动相构成为：流动相a相：10mm碳酸氢铵水溶液；流动相b相：甲醇/乙腈体积比为1/1。
8、在本发明的一些实施方式中，所述检测过程采用梯度洗脱，洗脱梯度如下：
9、 时间(min) 流速(ml/min) ％a ％b 变化曲率 0 0.4 25 75 0 9 0.4 25 75 0 10 0.4 5 95 0 13 0.4 5 95 0 13.5 0.4 25 75 0 14 0.4 25 75 0
10、。
11、在本发明的一些实施方式中，所述检测过程中还包括如下条件中的至少一项：
12、1)液相色谱仪：shimadzu lc；
13、2)色谱柱填料：c18有机杂化硅胶；
14、3)色谱柱规格：3μm 2.1×100mm；
15、4)柱温：40±5℃；
16、5)流速：0.4±0.1ml·min-1；
17、6)自动进样器温度：10±2℃；
18、7)进样量：10μl；
19、8)质谱仪：sciex triple quad 7500；
20、9)离子源：电喷雾离子源(esi)；
21、10)电离模式：正离子模式。
22、在本发明的一些实施方式中，所述检测过程中还包括如下条件中的至少一项：
23、1)液相色谱仪：shimadzu lc；
24、2)色谱柱：shim-pack scepter c18-120[metal free]，3μm 2.1×100mm；
25、3)柱温：40℃；
26、4)流速：0.4ml·min-1；
27、5)自动进样器温度：10℃；
28、6)进样量：10μl；
29、7)质谱仪：sciex triple quad 7500；
30、8)离子源：电喷雾离子源(esi)；
31、9)电离模式：正离子模式。
32、传统测试过程进样量大，更容易对仪器、色谱柱造成污染或损害，不利于大批量、长时间连续进样，需频繁进行维护或更换耗材，增加维护、维修及时间成本，降低效率。本发明方案进校体积仅为10μl，不易造成污染或损害，可大批量、长时间连续进样。本方法仅用10μl进样，即可满足检测要求，对于仪器、色谱柱相对友好，且单次处理可多次重复进样，方法容错率高。
33、此外，从检测效果来看，相关技术参考文献[1]未提供相关色谱图，文献[2-5]提供的色谱图显示定量下限响应低，信噪比较差；文献[2-4]提供的色谱图显示待测物出峰位置基线凸起，表明存在明显背景干扰，文献[3]和[5]提供的色谱图显示待测物出峰位置附近存在干扰峰，分离度较低等缺陷。本发明方案分离效果好，待测物出峰位置基线无明显升高，且无干扰峰影响。
34、在本发明的一些实施方式中，所述检测过程中还包括如下条件中的至少一项：
35、离子源温度(℃)：500℃；
36、喷雾电压(spray voltage)：2000v；
37、collision gas(cad)：6psi；
38、curtain gas(cur)：45psi；
39、ion source gas1(gs1)：60psi；
40、ion source gas2(gs2)：40psi；
41、q0d(v)：105v；
42、ep(v)：10v；
43、ce(v)：44v；
44、cxp(v)：12v。
45、质谱条件可参照本领域常规参数进行设置。
46、在本发明的一些实施方式中，所述经预处理后的生物基质的预处理步骤包括：取生物基质样品，除去蛋白质，加水上样到固相萃取柱中，加入乙腈洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，加入衍生剂进行衍生化反应，即得。本发明方案优化了固相萃取前的处理过程，即在上样前先进行蛋白沉淀处理，由此只需要200μl血浆样品，即可实现一批次96个样本的集中处理，整个处理时间低于液液萃取时间，所用试剂不含甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、己烷、等易挥发性有机溶剂，降低有机试剂对身体的损害。此外，固相萃取过程只需上样和洗脱两个步骤，无需额外的淋洗环节。因此样品前处理过程耗时明显缩短。通过本发明的蛋白沉淀加固相萃取前处理方法，除了可以达到文献报道方法更低的定量下限外(3pg·ml-1级别的血药浓度含量测定)，还可以显著减小血浆用量，非常适合临床试验样品分析，及其他小体积基质样品(脑脊液，泪液等)的检测分析。
47、在本发明的一些实施方式中，所述生物基质样品包括血浆、脑脊液、关节腔内液、泪液中的至少一种。
48、在本发明的一些实施方式中，所述生物基质样品的体积为200μl以上。相关技术参考文献[1-5]报道其单次检测所需使用样本量最低达400μl以上。药物临床试验中，受试者每个样品的采血量一般不会超过4ml，离心得到的血浆一般不超过2ml。且根据临床试验样本检测的一般特点，至少需要保存一份备用管，检测管至少能被检测两次，因此，相关技术中适合临床试验中的样本检测的方法极为有限，且即使单次检测血浆用量满足临床试验的要求，但其容错空间较小，而本发明方案最低仅需200μl，即可实现准确可靠的检测，这一突破性的进步极大地降低了样本量的要求，使得在药物临床试验中，即便是在样本量极为有限的情况下，也能进行高效、准确的检测工作，从而极大地提高了临床试验的可行性与效率。此外，由于本发明的容错空间较大，即使出现样本损失或操作失误的情况，也能通过备用样本或多次检测来确保数据的准确性，进一步增强了其在临床试验中的实用性。
49、在本发明的一些实施方式中，所述上样时加水量为除去蛋白质后体积量的1～2倍。
50、在本发明的一些实施方式中，洗脱时所述乙腈的添加量为生物基质样品体积的1～1.2倍。
51、在本发明的一些实施方式中，所述除去溶剂是通过氮吹除去溶剂，具体包括45～55℃氮气吹干。
52、在本发明的一些实施方式中，所述衍生剂包括丹酰氯。
53、在本发明的一些实施方式中，所述衍生剂通过与乙腈制备成溶液的形态添加，其中，衍生剂的浓度为1～2mg/ml。
54、在本发明的一些实施方式中，所述衍生剂的添加量与生物基质样品的质量体积比为0.75～1.5mg：2ml。
55、在本发明的一些实施方式中，所述衍生反应在碱性条件下进行，所述碱性条件的ph在10～12之间。
56、在本发明的一些实施方式中，所述碱性条件通过添加ph调节剂控制，所述ph调节剂包括碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
57、在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂的添加量与生物基质样品的体积比为2.5～3.5：8。
58、在本发明的一些实施方式中，所述ph调节剂的添加量与生物基质样品的体积比为3：8。
59、在本发明的一些实施方式中，所述衍生反应条件还包括反应温度为55～65℃，和/或，反应时间为8～12min。
60、在本发明的一些实施方式中，所述衍生反应条件还包括反应温度为60℃，和/或，反应时间为10min。
61、在本发明的一些实施方式中，所述固相萃取柱的填料为cleanert pep，容量2mg/孔。
62、在本发明的一些实施方式中，所述固相萃取柱在上样前经过甲醇活化，经正压压干，再用水平衡后正压压干。
63、根据本发明的另一个方面，提出了一种用于实现上述检测方法的试剂盒，包括如下试剂：
64、1)预处理试剂：乙腈、固相萃取柱、衍生剂和ph调节剂；
65、2)炔雌醇对照品、炔雌醇-d4对照品、溶剂、稀释剂；
66、其中，所述溶剂为甲醇水混合溶液，所述甲醇的体积占比为50％；所述稀释剂为空白血浆。
67、根据本发明的一种优选的实施方式的试剂盒，至少具有以下有益效果：通过本发明方案试剂盒进行生物基质炔雌醇检测，操作简便，具有良好的应用前景。
68、在本发明的一些实施方式中，所述固相萃取柱的填料为基于聚苯乙烯/二乙烯苯为基质材料的固相萃取柱。
69、在本发明的一些实施方式中，所述固相萃取柱的填料为cleanert pep。
70、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的定量结果判断标准：相关系数r2≥0.9801或r≥0.9900；校正标样的回算浓度应该在标示值的85％～115％范围内，定量下限应该在标示值的80％～120％范围内；至少75％的校正标样且最少6个浓度水平应符合上述标准。
71、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
1.一种检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：包括如下步骤：取经预处理后的生物基质，采用液相色谱-质谱联用仪进行检测；
2.根据权利要求1所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：检测过程中的流动相构成为：流动相a相：10mm碳酸氢铵水溶液；流动相b相：甲醇/乙腈体积比为1/1。
3.根据权利要求1或2所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：所述检测过程采用梯度洗脱，洗脱梯度如下：
4.根据权利要求1或2所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：所述检测过程中还包括如下条件中的至少一项：
5.根据权利要求1或2所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：所述检测过程中还包括如下条件中的至少一项：
6.根据权利要求1或2所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：所述经预处理后的生物基质的预处理步骤包括：取生物基质样品，除去蛋白质，加水上样到固相萃取柱中，加入乙腈洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，加入衍生剂进行衍生化反应，即得。
7.根据权利要求6所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：所述生物基质样品满足如下参数中的至少一项：1)所述生物基质样品包括血浆、脑脊液、关节腔内液、泪液中的至少一种；2)所述生物基质样品的体积为200μl以上。
8.根据权利要求6所述的检测生物基质中炔雌醇的方法，其特征在于：预处理过程中满足如下条件中的至少一项：
9.一种用于实现如权利要求1至8任一项所述的检测方法的试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述固相萃取柱的填料为cleanertpep。
