本发明涉及传感器设计，尤其涉及一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法。
背景技术：
1、长棘海星周期性暴发是导致珊瑚死亡的主要原因之一，对长棘海星进行有效监测有利于对其暴发进行早期预警和及时干预。然而，传统监测方法的检测灵敏度不足，导致调查结果低于长棘海星的实际种群密度，从而使得暴发预警滞后，错过早期预警的最佳时机。edna技术克服了传统视觉调查容易受长棘海星隐蔽性影响的缺点，因此在监测长棘海星方面具有良好的应用前景。电化学生物传感器因其灵敏度高，检测速度快，无线化设备，操作简单等特点可以满足edna快速检测的需求。但传统电化学dna传感器需要将捕获探针固定在电极表面再与目标dna或报告探针进行结合，固定过程比较复杂耗时，且电极表面探针的堆积密度不受控制，影响电化学检测效果。此外，由于异质界面上的空间位阻效应，表面结合的捕获探针构型自由度受到影响，导致可及性降低，影响dna探针的杂交效率。
2、根据已有的研究报道，均相电化学dna传感技术可以解决上述问题，该技术允许dna在均相溶液以最大的反应效率进行dna杂交和信号放大反应，可以有效克服电极修饰、探针固定和空间位阻等问题。另外，受洋流等环境因素影响，海洋环境中edna浓度较低，因此测试之前，常常需要对样品中的目标dna进行扩增。聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,pcr)是应用最广泛的dna扩增技术之一，但pcr技术需要昂贵的精准热循环设备，在资源有限的现场分析中受到限制。相比之下，重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymerase amplification,rpa)是一种基于重组酶、dna聚合酶和单链dna结合蛋白(ssbp)的等温扩增技术，无需昂贵的热循环设备可在恒定低温下实现指数扩增。
3、电化学dna传感器具有检测速度快、设备微型化和便携化等特点，在现场应用中具有巨大的前景。但传统传感器的构建常常需要将dna探针逐步构建在电极表面上再进行后续的杂交反应，这种电极修饰过程复杂繁琐且耗时，以及受异质结面的影响，在电极表面不利于dna探针之间的可及性，影响杂交效率。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，解决现有大多数电化学dna传感器的捕获探针固定和dna杂交反应均在电极表面进行，存在复杂繁琐的修饰过程和受空间位阻影响，导致灵敏度低的技术问题。
2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，所述方法包括如下步骤：
4、步骤1：进行dna探针的设计；
5、步骤2：进行均相电化学dna传感器的构建及电化学测试；
6、步骤3：均相电化学dna传感器原理分析；
7、步骤4：均相电化学dna传感器构建验证；
8、步骤5：均相电化学dna传感器的性能测试。
9、进一步地，步骤1中，dna探针的捕获探针序列为：gtcgtgactgggtaaacttttttttttttttt-(ch2)3-sh，信号探针的序列为：actggccgtcgttttaca-biotin，正向引物的系列为：gtttacccagtcacgac-c3-tcactcctccaagacgacca，反向引物的序列为：tgtaaaacgacggccagt-c3-gcaaggtccactgatcctcc；
10、引物在引物的尾部增加修饰，引物设计由两部分组成，一部分是用于对长棘海星的coi区域进行特异性扩增，另一部分是一段单链dna用于与cp或sp结合，中间加入一个spacer c3阻止聚合酶进一步扩增，使rpa产物两侧保留一段ssdna直接进行下一步杂交。
11、进一步地，步骤2中传感器的构建过程为，电极预处理：传感器构建前，对便携式金电极ge进行预处理以获得干净的电极表面，首先利用无尘纸轻轻擦拭ge表面，然后分别在乙醇和去离子水中超声5min，随后在0.5m h2so4溶液中使用循环伏安法对ge进行电化学表面清洁，以100mv/s的扫描速率，在-0.35v-1.5v的电位窗口进行30次循环扫描以去除电极表面的杂质；
12、mch/cp/mb的制备：将cp稀释在pbs中，pbs由1.76mm kh2po4、8.1mm na2hpo4和136.89mm nacl组成，ph为7.4，加入10mm tcep，在室温下避光处理60min进行s-s切割，然后取10μl马来酰亚胺功能化磁珠加入干净的离心管中，再加入100μl cp溶液充分振荡并孵育过夜，然后用洗脱液冲洗三次，随后加入100μl mch振荡30min封闭所有未结合的马来酰亚胺功能化位点，用洗脱液冲洗三次，最后重新悬浮在10μl洗脱液中得到mch/cp/mb；
13、进行杂交反应：在新的离心管中加入4.5μl的mch/cp/mb并放磁力架上进行磁珠分离，移去上清液，再加入45μl的rpa产物和45μl的sp利用涡旋仪振荡30min，然后再插入磁力架中进行磁珠分离，移去上清液，用洗脱液冲洗三次，最后重新悬浮在45μl洗脱液中得到磁珠复合物sp/tg/mch/cp/mb，电化学测试前放4℃下保存备用；
14、取10μl磁珠复合物滴加在金电极上，电极下方紧贴一块铁磁，通过磁铁与磁珠之间的磁性效应将磁珠复合物牢牢固定在电极表面，然后加入链霉亲和素/hrp孵育10min，用洗脱液冲洗三次，再加入150μl tmb开始电化学测试。
15、进一步地，洗脱液由1.76mm kh2po4、8.1mm na2hpo4、136.89mm nacl和0.05％v/vtween-20组成，ph为7.4。
16、5.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤2中电化学测试过程为，
17、所有电化学测试都在钰芯mecart vs1便携式电化学工作站进行，使用fr4印刷平面圆盘三电极系统，其中包括金电ge工作电极、ag/agcl参比电极和碳对电极，循环伏安法cv在5mm[fe(cn)6]3-/4-/0.1m kcl中进行电化学测试，i-t测试在tmb中进行，循环伏安法cv测试是在-0.2-0.5v的电位范围和100mv/s的扫描速率下进行，在-0.2v下进行i-t测试，当hrp氧化还原反应达到稳态后记录电催化还原电流。
18、进一步地，步骤3的具体过程为：均相电化学dna传感器原理由两部分组成，首先，引入rpa技术提高传感器的灵敏度，满足检测实际样品中相对低浓度edna的需求，利用一对带尾引物对长棘海星基因组dna进行扩增反应，其中带尾引物中间加入了c3阻止聚合酶进一步扩增，保证最后的rpa产物两侧各保留一段ssdna，马来酰亚胺化磁珠与巯基化的cp结合，然后通过cp与rpa产物一侧的ssdna结合，将rpa产物连接到磁珠上，rpa产物另一侧的ssdna与标记有生物素的sp杂交，当sp的生物素与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素特异性识别后，在tmb底物帮助下发生氧化还原反应，产生与目标dna定量相关的酶催化信号，电极表面产生显著的电流信号，同时，将磁铁附着在ge的下方，利用磁性效应将磁珠复合物固定到ge表面进行测试，节省传感器表面固定cp和修饰电极的时间，并且策略中所有的dna探针杂交反应都在均相液体中进行，避免了电极表面的空间位阻降低dna探针的杂交效率。
19、进一步地，步骤4的具体过程为：马来酰亚胺磁珠整体呈现团聚状态，但从表面可以清晰地区分开粒径较小的磁珠颗粒，当cp与磁珠结合后，磁珠表面形成一层薄膜，降低了磁珠颗粒之间的区分度，是由于cp上修饰的巯基与磁珠表面的马来酰亚胺官能团发生反应，形成化学键，使得cp固定在磁珠表面，从而形成紧密的dna分子层，有s元素和p元素的存在，分别来自cp的巯基和dna的磷酸骨架，含有p元素，表明cp已被成功固定在马来酰亚胺磁珠表面上；
20、把cv作为用于表征传感器的构建过程，存在一对显著的氧化还原峰，表明ge表面干净，[fe(cn)6]3-/4-在电极表面进行电子转移，测得显著的电化学信号，当在ge表面固定mb后，曲线(b)的电化学信号减弱，表明mb没有良好的导电性，当在ge表面加入mb复合物后，曲线电化学信号减小，这主因为dna带负电荷的磷酸骨架与[fe(cn)6]3-/4-之间产生静电排斥作用，阻碍[fe(cn)6]3-/4-到达电极表面进行电子转移，同时还有导电性较差的mch封闭mb的活性位点，因此使得电化学信号减小，通过cv的逐步变化证明传感器的成功构建。
21、进一步地，步骤5的具体过程为：
22、先进行灵敏度测试：
23、在实验条件为cp 500nm,mch 40μm,sp 500nm,杂交时间30min下，利用构建的传感器对长棘海星基因组dna梯度浓度进行i-t测试；
24、i-t测试的电流响应值随着dna浓度的增加而增加，在10fg/μl-1ng/μl范围内，电化学电流响应值与长棘海星基因组dna浓度的对数值呈现线性关系，并且该线性关系如公式(1)所示：
25、y＝0.683x+3.04，r2＝0.989 (1)
26、其中，y是电化学电流响应值，x是长棘海星基因组dna浓度的对数；
27、y＝s0+3σ (2)
28、其中，s0是空白样品测得的电流信号平均值，σ是空白样品电流信号平均值的标准偏差；
29、y＝s0+10σ (3)
30、其中，s0是空白样品测得的电流信号平均值，σ是空白样品电流信号平均值的标准偏差；
31、重现性、稳定性和特异性测试：
32、对电化学dna传感器的重现性进行评估，在与灵敏度测试相同的实验条件下，用五根平行电极测试1ng/μl的长棘海星基因组dna，五根平行电极的电化学响应结果，rsd为1.59％，证明该传感器具有良好的重现性，保证了传感器测试的准确性和稳定性，利用磁场作用将mb固定在电极表面测试，对mch/cp/mb的存储稳定性进行评估，在10天内进行若干次测试，电化学检测结果的rsd为3.67％，证明捕获探针功能化mb的储存具有良好的稳定性，且储存空间比设定值小，方便携带；
33、验证传感器的特异性，分别利用传感器检测长棘海星和珊瑚礁生态系统中若干物种的基因组dna，包括粒皮瘤海星、鹿角杯形珊瑚、美丽鹿角珊瑚、多鳞霞蝶鱼、条纹蝴蝶鱼，只有长棘海星实验组有比设定值大的电流信号，干扰物种的电化学响应值与空白实验组的响应一样，有小于预设值的电流信号，电化学dna传感器对若干个物种具抗干扰能力，保证传感器检测的准确性。
34、本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
35、(1)本发明的传感器表现出良好的灵敏度，检测线性范围为10fg/μl-1ng/μl，对长棘海星基因组dna的lod为2.02fg/μl(约10.10fm)，loq为3.77fg/μl(约18.85fm)。该传感器还有具有良好的重现性、长期稳定性和特异性。该方法中所有的dna杂交反应都在均匀的液相溶液中进行，避免了受电极表面空间位阻的影响降低杂交效率。同时利用rpa等温扩增技术，使得该方法在条件受限的现场检测中具有良好的应用前景，为长棘海星edna现场动态监测提供新的解决方案。
36、(2)该方法结合rpa等温快速扩增技术和均相溶液中dna杂交效率高的优点，提高了传感器的灵敏度和节省传感器的构建时间。为长棘海星edna现场动态监测提供了一种灵敏、快速便捷的电化学dna传感器。
1.一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤1中，dna探针的捕获探针序列为：gtcgtgactgggtaaacttttttttttttttt-(ch2)3-sh，信号探针的序列为：actggccgtcgttttaca-biotin，正向引物的系列为：gtttacccagtcacgac-c3-tcactcctccaagacgacca，反向引物的序列为：tgtaaaacgacggccagt-c3-gcaaggtccactgatcctcc；
3.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤2中传感器的构建过程为，电极预处理：传感器构建前，对便携式金电极ge进行预处理以获得干净的电极表面，首先利用无尘纸轻轻擦拭ge表面，然后分别在乙醇和去离子水中超声5min，随后在0.5m h2so4溶液中使用循环伏安法对ge进行电化学表面清洁，以100mv/s的扫描速率，在-0.35v-1.5v的电位窗口进行30次循环扫描以去除电极表面的杂质；
4.根据权利要求3所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：洗脱液由1.76mm kh2po4、8.1mm na2hpo4、136.89mm nacl和0.05％v/v tween-20组成，ph为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤2中电化学测试过程为，
6.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤3的具体过程为：均相电化学dna传感器原理由两部分组成，首先，引入rpa技术提高传感器的灵敏度，满足检测实际样品中相对低浓度edna的需求，利用一对带尾引物对长棘海星基因组dna进行扩增反应，其中带尾引物中间加入了c3阻止聚合酶进一步扩增，保证最后的rpa产物两侧各保留一段ssdna，马来酰亚胺化磁珠与巯基化的cp结合，然后通过cp与rpa产物一侧的ssdna结合，将rpa产物连接到磁珠上，rpa产物另一侧的ssdna与标记有生物素的sp杂交，当sp的生物素与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素特异性识别后，在tmb底物帮助下发生氧化还原反应，产生与目标dna定量相关的酶催化信号，电极表面产生显著的电流信号，同时，将磁铁附着在ge的下方，利用磁性效应将磁珠复合物固定到ge表面进行测试，节省传感器表面固定cp和修饰电极的时间，并且策略中所有的dna探针杂交反应都在均相液体中进行，避免了电极表面的空间位阻降低dna探针的杂交效率。
7.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤4的具体过程为：马来酰亚胺磁珠整体呈现团聚状态，但从表面可以清晰地区分开粒径较小的磁珠颗粒，当cp与磁珠结合后，磁珠表面形成一层薄膜，降低了磁珠颗粒之间的区分度，是由于cp上修饰的巯基与磁珠表面的马来酰亚胺官能团发生反应，形成化学键，使得cp固定在磁珠表面，从而形成紧密的dna分子层，有s元素和p元素的存在，分别来自cp的巯基和dna的磷酸骨架，含有p元素，表明cp已被成功固定在马来酰亚胺磁珠表面上；
8.根据权利要求1所述的一种现场检测长棘海星edna的均相传感器设计方法，其特征在于：步骤5的具体过程为：
