本技术属于免疫细胞，具体涉及一种car-nk细胞培养的滋养层细胞、制备方法及病毒载体质粒。
背景技术：
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)主要由三个功能域构成，分别是胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scfv)及一段起连接作用的铰链区(hinge)构成，胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。鉴于car-t细胞疗法的成功，由此衍生了car-nk、car-nkt、car-巨噬细胞(car-m)、car-treg、car-γδt等一系列以car技术为核心的新型细胞疗法。
2、nk细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。新近的临床研究及临床前研究结果均显示car-nk细胞对于急性髓系白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等恶性血液肿瘤及胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等实体瘤都具有较强的抗肿瘤效应且不良反应较小，在细胞治疗行业有较好的研究前景和价值。
3、目前car基因转导的两大系统是转座子基因转导系统和基于慢病毒、逆转录病毒的转导体系。nk细胞由于天然具有抵抗病毒入侵的功能，并且细胞表面缺乏相应病毒识别的受体，因此利用病毒转导的效率极低。目前主流做法是采用特殊病毒衣壳，如rd114a或baev。原代nk细胞的病毒转导效率通常依赖于促进病毒进入细胞的化学试剂,如阳离子聚丙烯和鱼精蛋白硫酸盐。然而,这些试剂显示出对nk-92细胞的毒性,因此替代试剂如deae-葡聚糖和多聚-l-赖氨酸,近年来也被使用。此外,无毒的阳离子多肽,如retronectin，也被用于转染外周血来源的nk细胞,并显示出比其他化学试剂更高的转染效率。除了促进病毒转导的化合物外，抑制nk细胞抗病毒反应的物质也可用于增强转导。经证明抑制nk细胞的tbk1/ikkε复合物，可有效提高慢病毒基因转导效率。尽管以上方法可以在一定程度上提高病毒对nk细胞的转导效率，但转导率低仍然是限制nk基因修饰的重大挑战。同时申请人研究发现培养过程中转导的nk细胞car表达持续下降。因此，有必要在培养过程中维持或提高car-nk细胞的比例。
4、目前nk细胞培养扩增多采用k562滋养层细胞，经改造的滋养层细胞可以提供nk细胞生长所需的共刺激信号和细胞因子。本技术在传统的滋养层细胞上表达car-nk细胞中car结构能特异性识别的靶点，从而激活cd3z介导的细胞信号通路，从而达到在培养过程中进一步富集car-nk细胞的作用。
技术实现思路
1、本技术针对现有技术的不足，本技术提供一种car-nk细胞、滋养层细胞、其制作方法及应用，该滋养层细胞可以提供car-nk细胞生长所需的共刺激信号和细胞因子，达到在培养过程中进一步富集car-nk细胞的作用。
2、本技术的技术方案如下：
3、第一方面，本技术提供一种用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，所述用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法包括：
4、步骤s1.构建重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒，所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒包括cd137l序列，膜结合il15序列,膜结合il21序列，以及car结构中scfv结构能够识别的靶点序列；
5、步骤s2.将所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒包装得到重组慢病毒或重组逆转录病毒；
6、步骤s3.用所述重组慢病毒或重组逆转录病毒感染k562滋养层细胞；
7、步骤s4.将病毒感染后的k562滋养层细胞进行单克隆分选、扩增以及流式检测得到高表达cd137l、膜结合il-21、膜结合il-15和靶蛋白全长或靶蛋白胞外段的k562滋养层细胞；
8、步骤s5.使用伽马射线辐照处理同时表达cd137l、膜结合il-21、膜结合il-15和car结构中scfv结构能够识别的靶点蛋白的k562滋养层细胞，得到用于car-nk细胞培养的滋养层细胞。
9、在本技术的一些实施例中，所述步骤s1的car结构中scfv结构能够识别的靶点蛋白包括cd19,bcma,cd20,cd22,cd30,cd33,cd123,cd5,cd7,cd70,msln,gucy2c,egfrviii,claudin18.2,gd2,gprc5d,psma,ror1,fap,erbb2(her2/neu),muc1,egfr,caix,wt1,ny-eso-1,cd79a,cd79b,gpc3,b7-h3或者tag72中的至少一种。
10、在本技术的一些实施例中，所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒包括：
11、将cd137l和靶点蛋白通过连接肽连接得到嵌合序列；
12、将il15与铰链区、跨膜区连接得到膜结合il15；
13、将il21与铰链区、跨膜区连接得到膜结合il21；
14、通过连接肽连接所述膜结合il15与所述膜结合il21；
15、其中，cd137l、靶点蛋白、膜结合il15和膜结合il21可自由组合构建在同一个或不同慢病毒载体或逆转录病毒载体上得到所述重组慢病毒质粒或重组逆转录病毒质粒；靶点蛋白可表达全长或者胞外段偶联铰链区和跨膜区；所述连接肽为t2a,p2a,e2a或f2a。
16、在本技术的一些实施例中，所述步骤s1的重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒的跨膜区选自以下蛋白质的跨膜区中的至少一个：
17、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154及其功能性片段。
18、在本技术的一些实施例中，所述步骤s1的重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒的铰链区选自以下至少一种蛋白的铰链区：cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos、cd154或igg家族。
19、第二方面，本技术提供一种用于car-nk细胞培养的滋养层细胞，所述用于car-nk细胞培养的滋养层细胞由所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法制得。
20、第三方面，本技术提供所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞在培养car-nk细胞中的应用。
21、第四方面，本技术提供一种car-nk细胞扩增培养基，所述培养基包括基础培养基及所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞。
22、第五方面，本技术提供一种car-nk细胞培养方法，所述car-nk细胞培养方法包括以下步骤：
23、步骤s6.分离pbmc得到cd56+的nk细胞。
24、步骤s7.使用所述培养基培养nk细胞得到car-nk细胞。
25、第六方面，本技术提供一种重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒，其特征在于所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒包括cd137l序列，膜结合il15序列,膜结合il21序列，以及car结构中scfv结构能够识别的靶点序列。
26、与现有技术相比，本技术提供的一种用于培养car-nk细胞的滋养细胞的制备方法至少具有以下有益效果：
27、制备同时表达cd137l、膜结合il-21、膜结合il-15和car结构中scfv结构能够识别的靶点蛋白的k562滋养层细胞，可用于培养car-nk细胞。
28、本技术制备的滋养层细胞可以显著提高car-nk细胞的扩增效率和杀伤效果；带有靶点蛋白的滋养层细胞用于培养car-nk细胞扩增效率明显好于对照组，car阳性率随着培养时间缓慢上升，对照组则呈下降趋势；制备得到的car-nk细胞具有更强的杀伤能力。
29、本技术所述的滋养层细胞制备方法操作简单，成功率高，可实现car-nk细胞的高效、快速、大量扩增培养，为car-nk细胞的科学研究及推广应用提供了技术基础。
1.一种用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，其特征在于，所述用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，其特征在于，所述car结构中scfv结构能够识别的靶点蛋白包括cd19,bcma,cd20,cd22,cd30,cd33,cd123,cd5,cd7,cd70,msln,gucy2c,egfrviii,claudin18.2,gd2,gprc5d,psma,ror1,fap,erbb2(her2/neu),muc1,egfr,caix,wt1,ny-eso-1,cd79a,cd79b,gpc3,b7-h3或者tag72中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，其特征在于，所述步骤s1包括：将cd137l和靶点蛋白通过连接肽连接得到嵌合序列；
4.根据权利要求3所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒的跨膜区选自以下蛋白质的跨膜区中的至少一个：
5.根据权利要求3所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒的铰链区选自以下至少一种蛋白的铰链区：
6.一种用于car-nk细胞培养的滋养层细胞，其特征在于，所述用于car-nk细胞培养的滋养层细胞由权利要求1-5任一项所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞制备方法制得。
7.根据权利要求6所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞在培养car-nk细胞中的应用。
8.一种car-nk细胞扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基及权利要求6所述的用于car-nk细胞培养的滋养层细胞。
9.一种car-nk细胞培养方法，其特征在于，所述car-nk细胞培养方法包括以下步骤：
10.一种重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒，其特征在于所述重组慢病毒载体质粒或重组逆转录病毒载体质粒包括cd137l序列，膜结合il15序列，膜结合il21序列，以及car结构中scfv结构能够识别的靶点序列。
