本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的递送、工程化、优化和治疗应用，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)及其组分的基因组干扰或基因编辑。具体而言，本发明涉及用于递送crispr-cas系统以在动物(包括哺乳动物)体内经由基因组编辑实现治疗益处的体外、离体和/或体内系统、方法和组合物。关于联邦资助研究的声明本发明是在由美国国立卫生研究院颁发的nih先锋奖(pioneer award)(1dp1mh100706)以及同样由美国国立卫生研究院提供的基金1dp1od009552的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
1、在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指(zfn)、转录激活子样效应因子(tale)、或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。
技术实现思路
1、尽管在药物开发中提出了有效的治疗假设并且做出了强有力的努力，但是使用小分子治疗具有强遗传贡献的疾病仅取得了数目有限的成功。因此，迫切需要能够修饰受疾病影响的细胞和组织内的核酸的治疗策略的具替代性且稳健的系统。将crispr-cas系统加入治疗性基因组工程化方法的组库中显著简化了方法学并且加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关的遗传因子进行编目和映射，开发遗传疾病的动物模型以及开发安全的、有效的治疗替代方案的能力。为了有效而无有害作用地利用crispr-cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化、优化和细胞类型/组织/器官特异性递送等方面是至关重要的，这些方面是所要求的本发明方面。本发明的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。
2、示例性crispr复合物可以包括与指导序列复合的crispr酶(例如，cas9)，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。申请人已经优化了crispr-cas基因组工程化系统的组分，包括使用来自金黄色葡萄球菌的sacas9。不同递送手段可以用于将crispr-cas系统的组分离体和/或体内地递送至细胞、组织和器官。申请人已经将crispr-cas系统组分(例如，包含sacas9)有效地包装进病毒递送载体(例如，aav)中，并且已经证明它可以用于体内地修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列。申请人发明的关键特征在于它有效地解决了(治疗组分的)体内递送效率低和同源定向修复(hdr)效率低的挑战，并且具体而言，与共递送相关联的挑战通过小cas9(来自金黄色葡萄球菌的sacas9)得到了解决，该小cas9可以被容易地包装进单个腺相关病毒(aav)载体中来表达cas9蛋白及其相应的一种或多种sgrna两者。此外，重要的是，申请人已经表明引入小sacas9已经将进行hdr所需的病毒载体数目从3个载体降至2个载体。在本发明的方面中，粒子可以用于递送crispr-cas系统的一种或多种组分。并且有待接触的粒子的数目可以是一或二。在一方面，本发明提供了使用crispr-cas系统的一个或多个元件的方法。本发明的crispr复合物为修饰基因组座位中的靶多核苷酸提供了有效手段，其中该基因组座位与突变相关，包括与异常蛋白质表达或与疾病状况或状态相关联的突变。本发明的crispr复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)基因组座位内的靶多核苷酸，包括这样的靶座位的编码、非编码或调节元件内的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的crispr复合物在例如基因或基因组编辑、基因治疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。本发明的方面涉及在具备具有优化活性的指导rna的crispr-cas9系统中的、具有改进的靶向特异性的、在长度上小于野生型cas9酶的cas9酶和编码它的核酸分子、和嵌合的cas9酶、以及改进cas9酶的靶特异性或设计crispr-cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导rna和/或选择或制备具有比野生型cas9更小的尺寸或长度的cas9酶，由此将编码它的核酸包装到更高级的递送载体(因为在该递送载体中对它的编码少于野生型cas9)中，和/或产生嵌合cas9酶。还提供了本发明的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们在基因或基因组编辑中的用途。
3、在本发明中，该cas酶可以是野生型cas9，包括任何天然存在的细菌cas9。cas9直向同源物典型地共享3-4个ruvc结构域和一个hnh结构域的通用结构。最5’的ruvc结构域切割非互补链，而hnh结构域切割互补链。所有符号都是就指导序列而言的。在5’ruvc结构域中的催化残基是通过该感兴趣的cas9与其他cas9直向同源物(来自化脓链球菌ii型crispr位点、嗜热链球菌crispr位点1、嗜热链球菌crispr位点3、以及凶手弗朗西斯菌(franciscilla novicida)ii型crispr位点)的同源性比较而鉴定的，并且保守性asp残基(d10)被突变为丙氨酸以将cas9转化成互补链切口酶。类似地，在hnh结构域中的保守性his和asn残基被突变为丙氨酸以将cas9转化为非互补链切口酶。在一些实施例中，这两组突变都可以进行，将cas9转化为非切割酶。因此，该cas酶可以是野生型cas9，包括任何天然存在的细菌cas9。该crispr、cas或cas9酶可以针对人类细胞(包括特定类型的人类细胞)进行密码子优化，或是修饰形式，包括任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在本发明的另外方面，cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合的通用dna结合蛋白。这些突变可以是人工引入的突变或获得性和丢失性功能突变。这些突变可以包括但不限于分别在ruvc和hnh催化结构域中的催化结构域(d10和h840)之一中的突变。已经表征了其他的突变。在本发明的一个方面，该转录激活结构域可以是vp64。在本发明的其他方面，该转录阻遏物结构域可以是krab或sid4x。本发明的其他方面涉及融合到结构域上的突变的cas 9酶，这些结构域包括但不限于，转录激活剂、阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histone remodeler)、脱甲基酶、dna甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。本发明可以涉及允许增强这些rna在细胞中的性能的sgrna或tracrrna或指导序列或嵌合指导序列。该c rispr酶可以是i型或iii型crispr酶，优选ii型crispr酶。这种ii型crispr酶可以是任何cas酶。优选的cas酶可以被鉴定为cas9，因为这可以是指与来自ii型crispr系统的具有多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的酶的通用类别。最优选地，该cas9酶来自或衍生自spcas9或sacas9。关于衍生，申请人意指该衍生的酶在很大程度上是基于与野生型酶具有高度序列同源性的含义，但是如本文所述它在某些方面已经被突变(修饰)。
4、应当理解的是，术语cas和crispr酶在本文中通常可互换地使用，除非另外说明。如上提及的，在本文中使用的许多残基编号是指来自化脓链球菌中的ii型crispr座位的cas9酶。然而，应当理解的是，本发明包括更多的来自其他微生物物种的cas9，如spcas9、sacas9、st1cas9等等。在本文中提供了另外的实例。熟练的技术人员将能够通过比较相关氨基酸序列而确定在除了spcas9之外的cas9酶中的适当的相应残基。因此，在特异性氨基酸置换是指使用spcas9编号的情况下，那么，除非上下文清楚说明，这并不预期是指其他cas9酶，本披露预期涵盖在其他cas9酶中的相应修饰。本文中提供了在这种情形下针对人类进行优化(即，针对在人类中表达进行优化)的密码子优化序列的实例，参见sacas9人类密码子优化序列。在这被优化的同时，应当理解其他实例是可能的并且针对宿主物种的密码子优化是已知的。本发明包括其中该cas9是嵌合cas9蛋白的方法。这些方法可以包括一种cas9同源物的一个或多个n末端片段与一种或多种其他或另一种cas9同源物的一个或多个c末端片段。应当理解的是，在本发明的方法中，在该生物是动物的情况下，该修饰可以离体地或在体外例如在细胞培养物中进行，并且在一些情况下不在体内进行。在其他实施例中，可以在体内进行。在一些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其crispr酶(包括或可替代地是编码crispr酶的mrna)，其中该靶序列在其3’端的侧翼为pam(原型间隔子邻近基序)序列，该pam序列包含5’-基序，尤其是在cas9是(或衍生自)化脓链球菌或金黄色葡萄球菌cas9的情况下。例如，适合的pam是针对spcas9或sacas9酶(或衍生的酶)的5’-nrg或5’-nngrr(其中n是任何核苷酸)。应当理解的是，spcas9或sacas9是来自或衍生自化脓链球菌或金黄色葡萄球菌cas9的那些。
5、在一个方面，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，其中该基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括：
6、递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
7、a)i.crispr-cas系统嵌合rna(chirna)多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
8、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
9、(b)tracr配对序列，和
10、(c)tracr序列，以及
11、ii.编码crispr酶的多核苷酸序列，该crispr酶包含至少一个或多个核定位序列，
12、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
13、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
14、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶，并且编码crispr酶的多核苷酸序列是dna或rna；并且
15、该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由病毒递送载体或粒子，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且
16、任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种病毒载体或粒子与所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。
17、在一个方面，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括：使细胞与含有非天然存在的或工程化的组合物接触，该组合物包含：i.(a)指导序列，该指导序列能够杂交到hsc中的靶序列上、和(b)至少一种或多种tracr配对序列；ii.crispr酶，任选地具有一个或多个nls；以及iii.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶；并且
18、该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由病毒递送载体或粒子，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且
19、任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种病毒载体或粒子与所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。
20、可以递送编码任何一种或多种或所有crispr-复合物的一种或多种多核苷酸，这一种或多种多核苷酸有利地连接至一个或多个调节元件用于例如经由一种或多种粒子在体内表达，这一种或多种粒子包含含有可操作地连接至这一个或多个调节元件的一种或多种多核苷酸的载体。编码crispr酶的多核苷酸序列、指导序列、tracr配对序列或tracr序列的任一者或全部可以是rna。应当理解的是，在提及作为rna并且被认为‘包含‘这样tracr配对序列的特征的多核苷酸的情况下，该rna序列包括该特征。在该多核苷酸是dna并且被认为包含这样tracr配对序列的特征的情况下，该dna序列被或者可以被转录成包括该讨论中的特征的rna。在该特征是蛋白质的情况下，如crispr酶，所提及的该dna或rna序列被或者可以被翻译(以及在dna首先被转录的情况下)。
21、在某些实施例中，本发明提供了通过操纵感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰生物(例如，哺乳动物，包括人类)或非人类哺乳动物或生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，例如经由与细胞或细胞群接触，其中该组合物包含一种或多种递送载体或粒子，该一种或多种递送载体或粒子包含一种或多种病毒、质粒或核酸分子载体(例如rna)，该一种或多种病毒、质粒或核酸分子载体(例如rna)可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一个crispr-cas系统嵌合rna(chirna)多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)一个能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码crispr酶的酶编码序列上，该c rispr酶包含至少一个或多个核定位序列(或者任选地至少一个或多个核定位序列，因为在一些实施例中可能不涉及nls)，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分i和ii位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶，或者(b)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统含有一种或多种载体，该一种或多种载体包含i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到(a)能够杂交到真核细胞中的靶序列上的指导序列、和(b)至少一种或多种tracr配对序列，ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码crispr酶的酶编码序列上，以及iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接到tracr序列上，其中组分i、ii和iii位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶。该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由接触该细胞或细胞群的递送载体或粒子，或使该细胞或细胞群与另一种含有该hdr模板的递送载体或粒子接触，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得表达所述异常蛋白的细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与表达所述异常蛋白的所述细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在一些实施例中，组分i、ii和iii位于相同载体上。在其他实施例中，组分i和ii位于相同载体上，而组分iii位于另一种载体上。在其他实施例中，组分i和iii位于相同载体上，而组分ii位于另一种载体上。在其他实施例中，组分ii和iii位于相同载体上，而组分i位于另一种载体上。在其他实施例中，组分i、ii和iii各自位于不同的载体上。本发明还提供了如本文所述的病毒或质粒载体系统。
22、通过操纵靶序列，申请人还打算靶序列的表观遗传操纵。这可以是靶序列的染色质状态的操纵，如借助于修饰靶序列的甲基化状态(即，甲基化或甲基化模式或cpg岛的添加或去除)、组蛋白修饰，从而增加或降低靶序列的可及性，或者借助于3d折叠。应当理解的是，在提及一种通过操纵在感兴趣的基因组座位中的靶序列来修饰一种生物或哺乳动物(包括人类或非人类哺乳动物或生物)的方法的情况下，这可适用于作为整体的生物(或哺乳动物)或者仅仅是来自这种生物的单个细胞或细胞群(如果该生物是多细胞的话)。在人类的情况下，例如，申请人特别地设想到单个细胞或细胞群，并且这些细胞可以优选地进行离体修饰，进而重新引入。在这种情况下，活组织检查或其他组织或生物流体样品可以必要的。在这方面，干细胞也是特别优选的。但是，当然还设想了体内实施例。并且，本发明对眼细胞、视网膜细胞、血管细胞、上皮细胞、内皮细胞和耳蜗细胞而言是尤其有利的。
23、在一些实施例中，本发明包括一种通过操纵细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位中的dna双链体的相对链上的第一靶序列和第二靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括例如通过使该细胞或细胞群与递送载体接触来递送，例如包含非天然存在的或工程化的组合物的病毒载体或粒子，该组合物包含：
24、i.第一crispr-cas系统嵌合rna(chirna)多核苷酸序列，其中该第一多核苷酸序列包含：
25、(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，
26、(b)第一tracr配对序列，和
27、(c)第一tracr序列，
28、ii.第二crispr-cas系统chirna多核苷酸序列，其中该第二多核苷酸序列包含：
29、(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，
30、(b)第二tracr配对序列，和
31、(c)第二tracr序列，并且
32、iii.编码crispr酶的多核苷酸序列，该crispr酶包含至少一个或多个核定位序列并且包含一个或多个突变，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列；或者
33、iv.i.至iii.中的一者或多者(例如，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列)的一种或多种表达产物，该crispr酶；
34、其中当转录时，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列分别杂交到该第一tracr序列和第二tracr序列上并且该第一指导序列和该第二指导序列分别指导第一crispr复合物和第二crispr复合物与该第一靶序列和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一crispr复合物包含与(1)杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交到该第一tracr序列上的第一tracr配对序列复合的crispr酶，其中该第二crispr复合物包含与(1)杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交到该第二tracr序列上的第二tracr配对序列复合的crispr酶，其中编码crispr酶的多核苷酸序列是dna或rna，并且其中该第一指导序列指导邻近该第一靶序列的dna双链体的一条链的切割并且该第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链断裂，由此修饰该生物或该非人类生物；并且该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由递送载体接触含有该hdr模板的该细胞或细胞群，或使该细胞或细胞群与另一种含有该hdr模板的递送载体接触，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地，该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞或细胞群，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与该细胞或细胞群进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群。一种为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含病毒载体系统，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：
35、(a)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
36、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到crispr-cas系统rna多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含
37、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，
38、(b)tracr配对序列，和
39、(c)tracr序列，以及
40、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码sacas9的酶编码序列上，该sacas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，
41、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
42、其中组分i和ii位于该系统的相同或不同载体上，
43、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的sacas9，
44、或者
45、(b)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
46、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，
47、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码sacas9的酶编码序列，以及
48、iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，
49、其中组分i、ii和iii位于该系统的相同或不同载体上，
50、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的sacas9，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的一些方法中，编码crispr酶的多核苷酸序列、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列中的任一者或全部是rna。在本发明另外的实施例中，编码crispr酶的编码序列的多核苷酸、该第一和第二指导序列、该第一和第二tracr配对序列或该第一和第二tracr序列是rna，并且是经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪递送的；但是，有利的是经由病毒载体或粒子递送。在本发明的某些实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在一些实施例中，这些多核苷酸可以被包含在含有一种或多种载体的载体系统中。在本发明的优选实施例中，该crispr酶是一种cas9酶，例如spcas9或sacas9。在本发明的一个方面，该crispr酶在催化结构域中包含一个或多个突变，其中关于spcas9，这一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和d986a，例如d10a突变。在优选的实施例中，该第一crispr酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二crispr酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。在本发明的优选方法中，该第一指导序列引导邻近该第一靶序列的dna双链体的一条链的切割并且该第二指导序列引导邻近该第二靶序列的另一条链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。
51、关于crispr酶的突变，当该酶不是spcas9时，可以在相应于spcas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在spcas9中的任何或所有下列突变是优选的：d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和/或d986a；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。在一个方面，本发明提供了关于本文论述的任何或各个或所有实施例，其中该crispr酶包含至少一个或多个、或至少两个或更多个突变，其中该至少一个或多个突变或该至少两个或更多个突变是关于根据spcas9蛋白的d10、e762、h840、n854、n863、或d986，例如，关于spcas9的d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和/或d986a，或根据sacas9的n580，例如，关于sacas9的n580a，或cas9的直向同源物中与sp或sa对应的任何一个或多个突变，或该crispr酶包含至少一个突变，其中至少关于sp cas9的h840或n863a或关于sa cas9的n580a是突变的；例如，其中该crispr酶包含h840a、或d10a和h840a、或d10a和n863a，根据spcas9蛋白，或cas9的直向同源物中与sp蛋白或sa蛋白对应的任何一个或多个突变。
52、在一些实施例中，本发明包括一种通过操纵细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位中的dna双链体的相对链上的第一靶序列和第二靶序列来修饰生物或非人类生物的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，该方法包括例如通过使该细胞或细胞群与一种或多种包含非天然存在的或工程化的组合物的递送载体接触来递送，该组合物包含：
53、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)第一指导序列，该第一指导序列能够杂交到该第一靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，
54、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至(a)第二指导序列，该第二指导序列能够杂交到该第二靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，
55、iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至编码crispr酶的酶编码序列，以及
56、iv.第四调节元件，该第四调节元件可操作地连接至tracr序列，v i.至iv.中的一者或多者(例如，该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列)的一种或多种表达产物，该crispr酶；
57、其中组分i、ii、iii和iv位于该系统的相同或不同载体上，在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该第一和第二指导序列分别指导第一和第二crispr复合物与该第一和第二靶序列的序列特异性结合，其中该第一crispr复合物包含与(1)杂交到该第一靶序列上的第一指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶，其中该第二crispr复合物包含与(1)杂交到该第二靶序列上的第二指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的crispr酶，其中编码c rispr酶的多核苷酸序列是dna或rna，并且其中该第一指导序列指导邻近该第一靶序列的dna双链体的一条链的切割，并且该第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割，从而诱导双链的断裂，由此修饰该生物或非人类生物；并且该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由的递送载体或粒子接触含有该hdr模板的细胞或细胞群，或使细胞或细胞群与另一种含有该hdr模板的粒子接触，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞或细胞群，任选地扩增这些细胞，使一种或多种递送载体或粒子与该细胞或细胞群进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群，并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的hsc。
58、本发明还提供了如本文所述的载体系统。该系统可以包含一种、二种、三种或四种不同的载体。组分i、ii、iii和iv因此可以被定位在一种、两种、三种或四种不同的载体上，并且在此设想了针对这些组分的可能位置的所有组合，例如：组分i、ii、iii和iv可以位于相同载体上；组分i、ii、iii和iv可以各自位于不同的载体上；组分i、ii、iii和iv可以位于总计两种或三种不同载体上，其中设想了位置的所有组合，等。在本发明的一些方法中，编码crispr酶的多核苷酸序列、该第一指导序列和该第二指导序列、该第一tracr配对序列和该第二tracr配对序列或该第一tracr序列和该第二tracr序列中的任一者或全部是rna。在本发明另外的实施例中，该第一和第二tracr配对序列共享100％的一致性和/或该第一和第二tracr序列共享100％的一致性。在本发明的优选实施例中，该crispr酶是一种cas9酶，例如spcas9。在本发明的一个方面，该crispr酶在催化结构域中包含一个或多个突变，其中关于spcas9，这一个或多个突变选自下组，该组由以下各项组成：d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和d986a；例如，d10a突变。在优选的实施例中，该第一crispr酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且该第二crispr酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。在本发明的一个另外的实施例中，这些病毒载体的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送；但是，病毒递送或粒子递送是有利的。
59、在本发明的优选方法中，第一指导序列指导邻近该第一靶序列的dna双链体的一条链的切割并且第二指导序列指导邻近该第二靶序列的另一条链的切割从而产生5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。
60、在一些实施例中，本发明包括一种修饰细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，这是通过向该细胞或细胞群中引入一种或多种递送载体或粒子，例如通过使该细胞或细胞群与一种或多种递送载体或粒子接触，这一种或多种递送载体或粒子包含具有一个或多个突变的cas蛋白和两种指导rna，这两种指导rna分别靶向该细胞或细胞群中的dna分子的第一链和第二链，由此这些指导rna靶向该dna分子并且该cas蛋白使该dna分子的第一链和第二链的每一者产生切口，由此改变该细胞或细胞群中的靶标；并且，其中该cas蛋白和这两种指导rna并不天然地一起存在，并且该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由递送载体或粒子接触含有该hdr模板的细胞或细胞群，或使细胞或群体与另一种含有该hdr模板的递送载体或粒子接触，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞，任选地扩增该细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与这些细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的优选方法中，该cas蛋白使该dna分子的第一链和第二链的每一者产生切口导致5’突出端。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至多200个碱基对、优选至多100个碱基对、或更优选至多50个碱基对。在本发明的实施例中，该5’突出端具有至少26个碱基对、优选至少30个碱基对、或更优选34-50个碱基对。本发明的实施例还包括包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列的指导rna。在本发明的一个方面，该cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中中表达。在本发明另外的实施例中，该cas蛋白是一种ii型crispr-cas蛋白，例如一种cas 9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该cas蛋白是cas9蛋白，例如spcas9或sacas9。在本发明的方面中，就spcas9而言，该cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和d986a；例如，d10a突变。本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的dna分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。
61、在一些实施例中，本发明包括一种修饰细胞或细胞群中的感兴趣的基因组座位的方法，例如其中该感兴趣的基因组座位与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关，这是通过向该细胞或细胞群中引入递送载体或一种或多种粒子，例如通过使该细胞或细胞群与递送载体或一种或多种粒子接触，这递送载体或一种或多种粒子包含：
62、a)第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到两种crispr-cas系统指导rna的每一者，这两种指导rna分别靶向该细胞或该细胞群内的细胞的双链dna分子的第一链和第二链，和
63、b)第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至cas蛋白，或
64、c)a)或b)的一种或多种表达产物，
65、其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，由此这些指导rna靶向该细胞或该细胞群内的细胞的dna分子，并且该cas蛋白使该细胞或该细胞群内的细胞的dna分子的第一链和第二链的每一者产生切口；并且，其中该cas蛋白和这两个指导rna并不天然地一起存在；并且该方法还可以任选地包括递送hdr模板，例如经由的递送载体或粒子接触含有该hdr模板的细胞或细胞群，或使细胞或细胞群与另一种含有该hdr模板的粒子接触，其中该hdr模板提供该蛋白的正常或较不异常形式的表达；其中“正常”是就野生型而论，并且“异常”是引起病症或疾病状态的蛋白质表达；并且任选地该方法可以包括从该生物或非人类生物分离或获得细胞，任选地扩增所述细胞群，使一种或多种递送载体或粒子与这些细胞进行接触以获得修饰的细胞群，任选地扩增该修饰的细胞群并且任选地向该生物或非人类生物给予修饰的细胞。在本发明的方面中，这些指导rna可包含融合到tracr配对序列和tracr序列上的指导序列。在本发明的一个实施例中，该cas蛋白是一种ii型crispr-cas蛋白。在本发明的一个方面，该cas蛋白经密码子优化以便在真核细胞，优选哺乳动物细胞或人类细胞中表达。在本发明另外的实施例中，该cas蛋白是一种ii型crispr-cas蛋白，例如一种cas 9蛋白。在一个高度优选的实施例中，该cas蛋白是cas9蛋白，例如spcas9或sacas9。在本发明的方面中，关于spcas9，该cas蛋白具有一个或多个选自下组的突变，该组由以下各项组成：d10a、e762a、h840a、n854a、n863a和d986a；例如，d10a突变。本发明的方面涉及被减少的基因产物或被进一步引入到编码基因产物的dna分子中的模板多核苷酸或通过允许两个5’突出端重新退火并连接而被精确切断的间插序列的表达、或被改变的基因产物的活性或功能、或被增加的基因产物的表达。在本发明的一个实施例中，该基因产物是一种蛋白质。在本发明的优选实施例中，该系统的这些载体是病毒载体。在一个另外的实施例中，该系统的这些载体经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送；并且粒子是优选的。在一个方面，本发明提供了一种修饰细胞或细胞群中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许crispr复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该crispr复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的crispr酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在一些实施例中，所述切割包括通过所述crispr酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体或其一种或多种表达产物例如经由一种或多种递送载体或粒子递送到所述细胞或细胞群中，其中这一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该crispr酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、和该tracr序列。在一些实施例中，所述载体被递送到受试者体内的细胞或细胞群中。在一些实施例中，所述修饰发生在细胞培养物中的所述细胞或细胞群中。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述修饰之前从受试者体内分离所述细胞或细胞群。在一些实施例中，该方法进一步包括使所述细胞或细胞群和/或从中衍生的细胞返回到所述受试者体内。
66、在一个方面，本发明提供了一种产生包含突变的疾病基因的细胞或细胞群的方法。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)将一种或多种载体或其一种或多种表达产物例如经由一种或多种递送载体或粒子引入细胞或细胞群中，其中这一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：crispr酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、和tracr序列；并且(b)允许crispr复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述疾病基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr上的该tracr配对序列复合的crispr酶，由此产生包含突变的疾病基因的细胞或细胞群。在一些实施例中，所述切割包括通过所述crispr酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，向动物给予该修饰的细胞或细胞群，以由此产生动物模型。
67、在一个方面，本发明提供了修饰细胞或细胞群中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许crispr复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该crispr复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列复合的crispr酶，其中所述指导序列连接到tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到tracr序列上。在其他实施例中，本发明提供了一种修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法，该真核细胞产生自表达异常蛋白质的细胞或细胞群。该方法包括通过使用结合到多核苷酸上的crispr复合物增加或降低靶多核苷酸在该细胞或细胞群中的表达；有利地，该crispr复合物经由一种或多种病毒递送载体或粒子递送。
68、在一些方法中，可以使靶多核苷酸失活以实施细胞或细胞群中的表达的修饰。例如，当crispr复合物结合到细胞中的靶序列上时，该靶多核苷酸失活，这样使得该序列不被转录，该编码蛋白不被产生，或者该序列不会像野生型序列一样起作用。
69、在一些实施例中，该功能结构域是一个转录激活结构域，优选vp64。在一些实施例中，该功能结构域一个转录阻遏结构域，优选krab。在一些实施例中，该转录阻遏结构域是sid、或sid的多联体(例如sid4x)。在一些实施例中，该功能结构域是一个表观遗传修饰结构域，从而提供了一种表观遗传修饰酶。在一些实施例中，该功能结构域是一种激活结构域，其可以是p65激活结构域。
70、本发明进一步包括本发明的组合物或其crispr复合物或酶或其rna(包括或可替代地是编码crispr酶的mrna)，其用于在医学或治疗中使用。在一些实施例中，本发明包括根据本发明的组合物或其组分，其用于在根据本发明的方法中使用。在一些实施例中，本发明提供了本发明的组合物或其crispr复合物或酶或其rna(包括或可替代地是编码crispr酶的mrna)在离体基因或基因组编辑，尤其是在细胞或细胞群中的用途，该细胞或细胞群任选地可以然后被引入从中获得该细胞或细胞群的生物或非人类生物或者相同物种的另一种生物或非人类生物中。在某些实施例中，本发明包括本发明的组合物或其crispr复合物或酶或其rna(包括或可替代地是编码crispr酶的mrna)在用于离体基因或基因组编辑中或在根据本发明的方法中使用的药剂的制造中的用途。在某些实施例中，本发明提供了一种治疗或抑制对其有需要的受试者(例如，哺乳动物或人类)或非人类受试者(例如，哺乳动物)的由感兴趣的基因组座位中的靶序列的缺陷所引起的病症的方法，该方法包括通过操纵细胞或细胞群中的靶序列来修饰该受试者或非人类受试者的该细胞或细胞群，并且向该受试者或非人类受试者给予修饰的细胞；有利地，细胞的修饰是通过使这些细胞与含有该crispr复合物或其组分的递送载体(例如，病毒)或粒子接触；有利地，在某些实施例中，该递送载体(病毒)或粒子还提供hdr模板或者另一种粒子或载体提供该hdr模板，并且其中该病症对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的。
71、该crispr cas复合物的某些rna也是已知的并且被称为sgrna(单一指导rna)。在有利的实施例中，该crispr cas复合物的rna是sgrna。该crispr-cas9系统已经被工程化为靶向细胞或细胞群中的一个或多个遗传座位。在本文制备并示例了cas9蛋白(有利地其针对真核细胞并且尤其是哺乳动物细胞，例如人类细胞(眼细胞、血管细胞、耳蜗细胞等)进行了密码子优化)和靶向细胞中的一个或多个座位(例如，基因rho、atoh1、vegfa)的sgrna。这些cas9蛋白和sgrna有利地经由病毒递送(aav)进行递送。当经由粒子递送时，这些粒子由混合的cas9蛋白和sgrna形成。将该sgrna和cas9蛋白混合物与以下混合物混合，该混合物包含表面活性剂、磷脂、生物可降解聚合物脂蛋白和醇或基本上由其组成或由其组成，由此形成含有该sgrna和cas9蛋白的粒子。本发明包括如此制备的粒子和来自这样一种方法的粒子及其用途。更一般地说，使用有效工艺形成粒子。首先，使cas9蛋白和靶向基因或对照基因lacz的sgrna在适合的温度(例如，15℃-30℃，例如，20℃-25℃，例如，室温)下以适合的摩尔比(例如，3：1至1：3或2：1至1：2或1：1)有利地在无菌、无核酸酶缓冲液(例如，1xpbs)中一起混合适合的时间(例如，15-45，如30分钟)。分开地，将粒子组分(如或包含：表面活性剂，例如阳离子脂质，例如1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)；磷脂，例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)；生物可降解聚合物，如乙二醇聚合物或peg，和脂蛋白，如低密度脂蛋白，例如胆固醇)溶解于醇(有利地c1-6烷基醇，如甲醇、乙醇、异丙醇，例如100％乙醇)中。将这两种溶液混合在一起以形成含有cas9-sgrna复合物的粒子。在某些实施例中，该粒子可以含有hdr模板。其可以是与含有sgrna+cas9蛋白的粒子共给予的粒子，或即，除使细胞或细胞群与含有sgrna+cas9蛋白的粒子接触之外，使该细胞或细胞群与含有hdr模板的粒子接触；或者使该hsc与含有全部的该sgrna、cas9和该hdr模板的粒子接触。该hdr模板可以通过分开的载体给予，由此在第一实例中，该粒子穿透hsc细胞并且该分开的载体也穿透该细胞，其中该hsc基因组被sgrna+cas9修饰并且该hdr模板也存在，由此基因组座位被该hdr修饰；例如，这可以导致突变的校正。在本文讨论中的粒子有利地通过将一种或多种sgrna和cas9蛋白的混合物(任选地含有一种或多种hdr模板或当就一种或多种模板而言分开的粒子是令人希望的时，这样的混合物仅含有一种或多种hdr模板)与以下混合物混合而获得或可获得，该混合物包括表面活性剂、磷脂、生物可降解聚合物、脂蛋白和醇或基本上由其组成或由其组成(其中一种或多种sgrna靶向与和异常蛋白质表达或和疾病状况或状态相关联的突变相关的一个或多个遗传座位)。
72、在一个方面，本发明提供了为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
73、(a)-i.crispr-cas系统rna多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
74、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，
75、(b)tracr配对序列，和
76、(c)tracr序列，以及
77、ii.编码cas9的多核苷酸序列，该cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，
78、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
79、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
80、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，并且编码cas9的多核苷酸序列是dna或rna，
81、或者
82、(b)i.多核苷酸，其包含：
83、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和
84、(b)至少一种或多种tracr配对序列，
85、ii.编码cas9的多核苷酸序列，以及
86、iii.包含tracr序列的多核苷酸序列，
87、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
88、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，并且编码cas9的多核苷酸序列是dna或rna。
89、在某些优选的实施例中，该cas9是sacas9。
90、在一个方面，本发明提供了为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，包括操纵所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含病毒载体系统，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包含：
91、(a)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
92、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到crispr-cas系统rna多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含
93、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，
94、(b)tracr配对序列，和
95、(c)tracr序列，以及
96、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码cas9(优选sacas9)的酶编码序列上，该cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
97、其中组分i和ii位于该系统的相同或不同载体上，
98、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
99、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，
100、或者
101、(b)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
102、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
103、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和
104、(b)至少一种或多种tracr配对序列，
105、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码cas9的酶编码序列，以及
106、iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，
107、其中组分i、ii和iii位于该系统的相同或不同载体上，
108、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
109、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9。
110、在一个方面，本发明提供了治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的方法，包括操纵对其有需要的受试者或非人类受试者体内的靶序列中的所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括通过操纵该靶序列来修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症或疾病对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包含以下项的治疗：
111、递送包含aav或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种aav或慢病毒载体，该一种或多种aav或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：
112、(a)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
113、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到crispr-cas系统rna多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含
114、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的该靶序列上，
115、(b)tracr配对序列，和
116、(c)tracr序列，以及
117、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码cas9(优选sacas9)的酶编码序列上，该cas9包含至少一个或多个核定位序列，
118、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
119、其中组分i和ii位于该系统的相同或不同载体上，
120、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
121、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，
122、或者
123、(b)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
124、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
125、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和
126、(b)至少一种或多种tracr配对序列，
127、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码cas9(优选sacas9)的酶编码序列，以及
128、iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，
129、其中组分i、ii和iii位于该系统的相同或不同载体上，
130、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
131、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9。
132、在某些实施例中，本发明提供了制备用于在根据本发明的任何方法中使用的aav或慢病毒载体的方法，该方法包括将含有编码该aav或慢病毒的一种或多种核酸分子或基本上由其组成的一种或多种质粒转染到aav感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该aav或慢病毒的复制和包装必须的aavaav或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。
133、在一个方面，本发明提供了一种用于在本发明的任何方法(例如，为与真核生物或非人类生物中的遗传座位相关的疾病建模的方法)中使用的组合物，所述方法包括操纵所述遗传座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列。在某些实施例中，本发明提供了该组合物在离体或体内基因或基因组编辑中的用途，包括治疗用途。
134、在一个方面，本发明提供了一种用于在药剂的制造中使用的组合物，该药剂用于体外、离体或体内基因或基因组编辑中、或用于在通过操纵与疾病相关的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用、或者在治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的方法中使用。
135、在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含：
136、(a)-i.crispr-cas系统rna多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
137、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，
138、(b)tracr配对序列，和
139、(c)tracr序列，以及
140、ii.编码cas9(优选sa cas9)的多核苷酸序列，该cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，
141、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
142、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
143、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，并且编码cas9的多核苷酸序列是dna或rna，
144、或者
145、(b)i.多核苷酸，其包含：
146、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和
147、(b)至少一种或多种tracr配对序列，
148、ii.编码cas9(优选sacas9)的多核苷酸序列，以及
149、iii.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
150、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的sacas9，并且编码cas9的多核苷酸序列是dna或rna；
151、用于在药物中或在疗法中使用；或用于在通过操纵与疾病或障碍相关的基因组座位中的靶序列来修饰生物或非人类生物的方法中使用；或用于在治疗或抑制真核生物或非人类生物的由与疾病相关的遗传座位中的一个或多个突变所引起的病症的方法中使用；或者用于在体外、离体或体内基因或基因组编辑中使用。
152、在一个方面，本发明提供了一种用于治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的治疗性基因组编辑方法，包括操纵对其有需要的受试者或非人类受试者体内的靶序列中的所述基因组座位的编码、非编码或调节元件内的靶序列，包括通过操纵该靶序列来修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症或疾病对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包含以下项的治疗：
153、递送包含aav或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种aav或慢病毒载体，该一种或多种aav或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：
154、(a)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
155、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到crispr-cas系统rna多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含
156、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的该靶序列上，
157、(b)tracr配对序列，和
158、(c)tracr序列，以及
159、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码cas9(优选sacas9)的酶编码序列上，该cas9包含至少一个或多个核定位序列，
160、其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
161、其中组分i和ii位于该系统的相同或不同载体上，
162、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
163、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的cas9，
164、或者
165、(b)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含
166、i.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
167、(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和
168、(b)至少一种或多种tracr配对序列，
169、ii.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码sacas9的酶编码序列，以及
170、iii.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，
171、其中组分i、ii和iii位于该系统的相同或不同载体上，
172、其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导crispr复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且
173、其中该crispr复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr上的tracr配对序列复合的cas9。
174、在一个方面，本发明提供了一种个体化或个性化治疗对这样的治疗有需要的受试者的遗传疾病的方法，该方法包括：
175、(a)将多个突变离体地引入包含一个或多个表达cas9(优选sa cas9)的真核细胞的组织、器官或细胞系中，或引入具有表达cas9的细胞的转基因非人类哺乳动物体内，包括向该组织、器官、细胞系或哺乳动物中的一个或多个细胞中递送如在本文讨论的载体，其中这些特异性突变或精确序列取代与或已经与该遗传疾病相关；
176、(b)用以下细胞测试针对该遗传疾病的一种或多种治疗，向这些细胞中已经递送该载体并且这些细胞具有与该遗传疾病相关联的这些特异性突变或精确序列取代；并且
177、(c)基于来自步骤(b)的一种或多种治疗的测试的结果治疗该受试者。
178、在本发明的任何上述方面和实施例的某些实施例中，该病毒载体可以是aav，例如aav1、aav2、aav5、aav7、aav8、aav dj或其任何组合。
179、在本文的关于与突变或与疾病状况相关的靶标的讨论中，这种突变或疾病状况可以是例如神经元疾病；眼病(例如，视网膜疾病，例如色素性视网膜炎；全色盲；年龄相关性黄斑变性；视力损害)，听觉疾病(例如，耳蜗细胞相关疾病、听觉损伤、耳聋)等。
180、因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合uspto(35u.s.c.§112，第一段)或epo(epc的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。
181、应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprise)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由......组成(consisting essentiallyof)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。可以有利的是，在本发明的实践中符合条款53(c)epc以及条例28(b)和(c)epc。在此文献中没有承诺。
182、这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
1.组合物在制备通过递送至受试者的神经元用于治疗神经元障碍的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
2.组合物在制备通过递送至受试者的耳蜗细胞用于治疗听觉遗传性疾病的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
3.一种组合物，包含列于附表2和附表3中的一种或多种pcr引物。
4.一种病毒载体，包含同源重组模板，其中，(a)所述模板包括靶向人rho座位的左同源臂和右同源臂以及位于所述左同源臂和右同源臂之间的靶突变位点用于校正人rho座位中的p23h突变，(b)所述模板包括靶向人cnga3座位的左同源臂和右同源臂以及位于所述左同源臂和右同源臂之间的靶突变位点用于校正人cnga3座位中的r277c或r283w突变，或(c)所述模板包括靶向人cngb3座位的左同源臂和右同源臂以及位于所述左同源臂和右同源臂之间的靶突变位点用于校正人cngb3座位中的1148delc突变。
5.一种crispr-cas系统指导，包括指导序列、tracr配对序列和tracr序列，其中，(a)所述指导序列靶向mecp2座位并且包括ccauucugcagagccagcag，(b)所述指导序列靶向dnmt1座位并且包括cgggcuggagcuguucgcgc，(c)所述指导序列靶向dnmt3a座位并且包括uuggcauggugcugcagg，或(d)所述指导序列靶向dnmt3b座位并且包括agagggugcccagcggguaug。
6.一种病毒载体，包含可操作地连接至金黄色葡萄球菌cas9的编码序列的通用组织特异型启动子和可操作地连接至crispr-cas系统指导的u6启动子。
7.组合物在制备通过递送至受试者的血管或心血管细胞用于治疗血管或心血管疾病的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
8.组合物在制备通过递送至受试者的肺或上皮细胞用于治疗肺或上皮细胞障碍的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
9.组合物在制备通过递送至受试者的内皮细胞用于治疗内皮细胞障碍的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
10.组合物在制备通过递送至受试者的肌细胞用于治疗肌肉或骨骼疾病的药剂中的用途，其中所述组合物包含crispr系统，所述系统包含：
