本发明涉及一种常染色体隐性遗传病的基因突变检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种长岛型(样)掌跖角化症的基因突变分型检测试剂盒及检测方法
背景技术：
1、长岛型掌跖角化症(nagashima-type palmoplantar keratoderma，nppk，omim615598)是一种非综合征型掌跖角化症，为常染色体隐性遗传模式。1977年，日本学者nagashima首次描述了这种不同于其他遗传性掌跖角化症的疾病[1]。此后，日本学者在本土又相继报道了20余例[2,3]。直到2008年，kabashima首次在英文文献中描述了这一疾病，并正式命名为“nagashima-type palmoplantar keratoderma”，中文名称：长岛型掌跖角化症[4]。自此，国内外皮肤科遗传学家开始逐渐认识这一疾病并展开研究。
2、nppk主要分布于中国、日本和韩国等东亚地区，是中国人群最常见的掌跖角化病，其在中国的患病率为0.975/10,000[5]。nppk特征性临床表现是掌跖部位界限清楚的淡红斑、弥漫性和轻度掌跖角化过度，皮疹延伸至手足背表面、手腕内侧、脚踝和跟腱等处。掌跖部位遇水后发白，手足多汗，手足异味等。除了复杂多样的临床症状外，不少长岛型掌跖角化症患者也会合并其他皮肤疾病，比如手足癣、甲真菌病和湿疹，明显影响患者生活质量[6]。
3、长岛型掌跖角化症最先确认是由serpinb7基因的双等位基因功能缺失性突变所致。serpinb7基因位于18q21.3，包含8个外显子，编码380个氨基酸。其编码的serpinb7蛋白是一种蛋白酶抑制剂。目前报道的serpinb7基因上nppk致病性突变有15种，c.122_127deltggtcc，c.218_219del2ins12，c.271delc，c.336+2t>g，c.382c>t，c.455g>t，c.455-1g>a，c.522dupt，c.530t>c，c.635delg，c.643a>g，c.650_653delctgt，c.796c>t，c.830c>t，c.1136g>a[7-9]。杨勇课题组研究先后确认c.796c>t、c.522dupt、c.650_653delctgt和c.455g>t突变为中国人群的始祖及高频突变，其中c.796c>t是东亚人群最常见的致病突变[10]。
4、最新研究结果表明serpina12双等位基因功能缺失性突变也可以导致nppk样临床表现。serpina12基因位于14q32.13，包含8个外显子，414个氨基酸，同样编码蛋白酶抑制剂。目前发现的serpina12的致病性突变有9种，c.439c>t、c.662dela、c.970_971del、c.1100g>a、c.631c>t、c.656a>g、c.1051g>t、c.635-7a>g c.637a>c[11-14]。其中c.970_971del和c.656a>g出现频率较高，c.970_971del被证实为始祖突变[13]。
5、与此同时，杨勇课题组的研究还发现serpina12及serpinb7的双基因杂合突变也可以导致患者出现nppk样临床表现，且有近10％的nppk患者携带serpina12基因致病性突变[14]。因此，对于临床上具有nppk样临床表现的患者(长岛型(样)掌跖角化症)，仅检测serpinb7基因会导致漏检、检测结果不准确的情况。基于此，本研发试剂盒将同时检测serpinb7和serpina12基因的常见致病突变，有助于提高检测的准确性。
6、目前遗传性疾病的诊断依靠基因测序技术，包括sanger测序和高通量测序。但该方法存在流程繁琐、结果分析复杂、检测成本高、普及性差的问题。因此快速、简便且经济实惠的实时荧光定量pcr成为分子诊断领域的主要方法。
7、通过pcr检测已知基因突变可以通过等位基因特异性pcr(allele specific pcr，as-pcr)技术来实现。该技术将引物3'最末端设计于突变碱基处，当用突变型引物进行pcr时，如果扩增到特异性条带，表明被测基因含有该突变位点。如果没有扩增到特异性条带，则表明没有该突变位点。该技术试验结果可靠，已得到广泛应用。
8、本发明提供一种能精确、全面且快速检测基因突变所致nppk的检测试剂盒，提高nppk基因突变分型检测的效率和准确性，本发明的检测试剂盒含有针对6个基因突变位点的检测，检测覆盖面广，基本可以覆盖几乎全部nppk患者的基因突变类型，显著提高了nppk基因突变类型分析的检测率，降低甚至避免了临床漏检导致误判的风险。
9、[1]nagashima,m.,palmoplantar keratoses.1977.
10、[2]mitsuhashi y and h.i,keratosis palmoplantarisnagashima.dermatologica,1989:p.179:231.
11、[3]y.,m.and h.i,keratosis palmoplantaris nagashima.dermatologica,1989:p.179-231.
12、[4]kubo,a.,a.shiohama,t.sasaki,et al.mutations in serpinb7,encoding amember of the serine protease inhibitor superfamily,cause nagashima-typepalmoplantar keratosis.am j hum genet,2013.93(5):p.945-956.
13、[5]liu j,chen z,hu l,et al.investigation of nagashima-typepalmoplantar keratoderma in china:a cross-sectional study of 234patients.jdermatol.2023；50(3):375-82.
14、[6]黄昕，陈志明，宋忠亚,等.长岛型掌跖角化症发病机制及治疗研究进展.皮肤科学通报.2020；第37卷(第1期):5-9，2.
15、[7]kubo a,shiohama a,sasaki t,et al.mutations in serpinb7,encoding amember of the serine protease inhibitor superfamily,cause nagashima-typepalmoplantar keratosis.am j hum genet.2013；93(5):945-56.
16、[8]hayakawa m,tahara u,ono n,et al.nagashima-type palmoplantarkeratosis caused by biallelic maternal mutation of serpinb7 with segmentaluniparental disomy of chromosome 18q.j dermatol.2020；47(12):e453-e4.
17、[9]yin j,xu g,wang h,et al.new and recurrent serpinb7 mutations inseven chinese patients with nagashima-type palmoplantar keratosis.j investdermatol.2014；134(8):2269-72.
18、[10]liu j,chen z,hu l,et al.three new founder mutations in chinesepatients with nagashima-type palmoplantar keratoderma.br j dermatol.2022；187(6):1043-5.
19、[11]mohamad j,sarig o,malki l,et al.loss-of-function variants inserpina12underlie autosomal recessive palmoplantar keratoderma.j investdermatol.2020；140(11):2178-2187.
20、[12]brandt e,harjama l,elomaa o,et al.a novel serpina12 variant andfirst european patients with diffuse palmoplantar keratoderma.j eur acaddermatol venereol.2024；38(2):413-418.
21、[13]liu y,tan y,liu j,et al.novel and founder variants of serpina12in chinese patients with autosomal recessive palmoplantar keratoderma.br jdermatol.2022；187(2):267-270.
22、[14]liu y,liu j,chen y,et al.potential digenic inheritance ofserpinb7 and serpina12 variants in chinese patients with nagashima-typepalmoplantar keratosis.br j dermatol.2024；191(1):136-138.
技术实现思路
1、本发明的目的是针对现有nppk基因突变分型检测过程中存在检测结果不准确，存在漏检，判断不准确、不全面等技术问题，提供一种nppk基因突变分型检测试剂盒及检测方法，本发明的检测试剂盒用于检测nppk基因突变的检测特异性强，灵敏度高；而且本发明试剂盒通过as-pcr及taqman探针技术可以精确、全面而且快速地检测nppk致病性基因突变的类型，减少了漏检几率，准确获得检测信息，提高了nppk的检测效率和检测准确；而且检测操作方法简单快捷，适宜大规模检测，检测通量高。
2、为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种用于nppk(长岛型(样)掌跖角化症)检测的试剂盒，包括6组检测基因突变位点的引物和对应的探针，其中，所述的6组基因突变位点为serpinb7基因上的4个位点：c.796c>t、c.522dupt、c.650_653delctgt、c.455g>t；serpina12基因上的2个位点c.970_971del及c.656a>g。
3、其中，所述检测基因位点包括突变型和野生型。
4、特别是，所述检测基因位点突变型引物、探针分别如下：
5、c.796c>t的突变型引物序列为seq id no.3、seq id no.4；探针序列为seq idno.21；
6、c.522dupt的突变型引物序列为seq id no.7、seq id no.6；探针序列为seq idno.22；
7、c.650_653delctgt的突变型引物序列为seq id no.10、seq id no.9；探针序列为seq id no.23；
8、c.455g>t的突变型引物序列为seq id no.11、seq id no.13；探针序列为seq idno.24；
9、c.970_971del的突变型引物序列为seq id no.16、seq id no.15；探针序列为seqid no.25；
10、c.656a>g的突变型引物序列为seq id no.19、seq id no.18；探针序列为seq idno.26。
11、特别是，所述检测基因的突变位点的野生型引物、探针分别如下：
12、c.796c>t的野生型引物序列为seq id no.1、seq id no.2；探针序列为seq idno.20；
13、c.522dupt的野生型引物序列为seq id no.5、seq id no.6；探针序列为seq idno.22；
14、c.650_653delctgt的野生型引物序列为seq id no.8、seq id no.9；探针序列为seq id no.23；
15、c.455g>t的野生型引物序列为seq id no.11、seq id no.12；探针序列为seq idno.24；
16、c.970_971del的野生型引物序列为seq id no.14、seq id no.15；探针序列为seqid no.25；
17、c.656a>g的野生型引物序列为seq id no.17、seq id no.18；探针序列为seq idno.26。
18、特别是，所述引物为根据检测基因的突变位点设计的实时荧光pcr扩增引物；所述探针为根据检测基因的突变位点设计的taqman探针。
19、特别是，所述探针的5′端的荧光基团相同，荧光基团的激发波长相同。
20、特别是，所述探针的5′端的荧光基团为fam、vic、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texas red、lc ted640、cy5、lc ted705或ned，优选为fam。
21、特别是，所述探针的3′端的淬灭基团的淬灭波长覆盖同一条探针上5′端荧光基团的激发波长。
22、特别是，所述淬灭基团为bhq1。
23、特别是，所述试剂盒还包括：阳性参照物、阴性参照物，其中所述阴性参照物为将serpinb7及serpina12目标基因，导入工具载体(pce3 blunt vector)后的质粒；所述阳性参照物为以阴性参照质粒为模版通过定点突变得到的质粒。
24、特别是，采用诺维赞ultra-universal topo cloning kit(货号c603)试剂盒进行阴性参照物的制备。
25、特别是，制备阴性参照物的过程中，serpinb7目的基因扩增正向引物序列为seqid no.27；serpinb7目的基因扩增反向引物序列为seq id no.28。
26、特别是，制备阴性参照物的过程中，serpina12目的基因扩增正向引物序列为seqid no.29；serpina12目的基因扩增反向引物序列为seq id no.30。
27、特别是，所述阴性参照物按照如下方法制备而成：以经sanger测序证实没有serpinb7基因及serpina12基因snp或致病性突变的正常人全血提取的dna为模板，进行pcr扩增；接着将pcr扩增产物进行ta克隆，将pcr扩增产物克隆到质粒pce3 blunt vector中，即得阴性对照质粒，用作阴性对照模板。
28、特别是，以含有目标检测位点的部分serpinb7基因的dna序列及serpina12基因的dna序列为目标序列，进行pcr扩增；接着将pcr扩增产物克隆到质粒pce3blunt vector中，质粒被命名为野生型，用作阴性对照模板。
29、特别是，所述部分serpinb7基因的dna序列为ncbi数据库中的ng_034150.1；所述部分serpina12基因的dna序列为ncbi数据库中为nc_000014.9。
30、特别是，所述阳性参照物按照如下方法制备而成：以阴性参照质粒为模版通过pcr扩增引入定点突变，得到目标片段后，通过同源重组反应得到的质粒。制作好的质粒均经过sanger测序验证。
31、特别是，以阴性参照物质粒为模板进行pcr扩增过程中，点突变的引物如下：
32、c.455g>t定点突变正向引物为seq id no.31；c.455g>t定点突变反向引物为seqid no.32；
33、c.522dupt定点突变正向引物为seq id no.33；c.522dupt点突变反向引物为seqid no.34；
34、c.796c>t定点突变正向引物为seq id no.35；c.796c>t定点突变反向引物为seqid no.36；
35、c.650_653delctgt定点突变正向引物为seq id no.37；c.650_653delctgt定点突变反向引物为seq id no.38；
36、c.970_971del定点突变正向引物为seq id no.39；c.970_971del定点突变反向引物为seq id no.40；
37、c.656a>g定点突变正向引物为seq id no.41；c.656a>g定点突变反向引物为seqid no.42。
38、特别是，采用诺维赞mut il fastmutagenesiskitv2(货号：c214)试剂盒进行阳性参照物的制备。
39、特别是，所述试剂盒还包括：qpcr扩增反应试剂盒，所述qpcr扩增反应试剂盒为诺维赞qpcr试剂盒，2×aceq universal u+probe master mix v2，货号：q513。
40、2×aceq universal u+probe master mix v2包含dntp/dutp mix，mg2+，acetaqdna polymerase(acetaq dna聚合酶)，heat-labile udg(热不稳定udg)。
41、本发明另一方面提供一种上述试剂盒在nppk(长岛型(样)掌跖角化症)基因突变检测中的应用。
42、本发明再一方面提供一种上述试剂盒的应用方法，包括如下步骤：
43、1)提取抗凝全血或口咽拭子的总dna，获得样本dna备用；
44、2)将试剂盒的试剂与样本dna置于pcr反应管中，进行实时荧光定量pcr扩增并检测荧光，根据测定的荧光ct值，判断基因突变位点，确定nppk基因突变分型。
45、特别是，步骤1)中采用dna提取试剂盒提取抗凝全血的dna。
46、特别是，还包括采用超微量分光光度计测定样本dna浓度。
47、特别是，步骤2)中qpcr扩增反应产物的ct值大于35，则表示未检测出对应的基因型，阴性；如果ct值小于35，则表示检测出对应的基因型，阳性，对应的基因位点发生突变。
48、特别是，步骤2)中实时荧光定量pcr反应过程中，qpcr反应体系如下：
49、
50、特别是，所述引物为基因突变位点的突变型、野生型引物、探针，其中所述基因位点为serpinb7基因上的4个位点：c.796c>t、c.522dupt、c.650_653delctgt、c.455g>t；serpina12基因上的2个位点c.970_971del及c.656a>g。
51、特别是，所述基因突变位点突变型对应的引物、探针分别如下：
52、c.796c>t的突变型引物序列为seq id no.3、seq id no.4；探针序列为seq idno.21；
53、c.522dupt的突变型引物序列为seq id no.7、seq id no.6；探针序列为seq idno.22；
54、c.650_653delctgt的突变型引物序列为seq id no.10、seq id no.9；探针序列为seq id no.23；
55、c.455g>t的突变型引物序列为seq id no.11、seq id no.13；探针序列为seq idno.24；
56、c.970_971del的突变型引物序列为seq id no.16、seq id no.15；探针序列为seqid no.25；
57、c.656a>g的突变型引物序列为seq id no.19、seq id no.18；探针序列为seq idno.26。
58、特别是，基因突变位点野生型对应的引物、探针分别如下：
59、c.796c>t的野生型引物序列为seq id no.1、seq id no.2；探针序列为seq idno.20；
60、c.522dupt的野生型引物序列为seq id no.5、seq id no.6；探针序列为seq idno.22；
61、c.650_653delctgt的野生型引物序列为seq id no.8、seq id no.9；探针序列为seq id no.23；
62、c.455g>t的野生型引物序列为seq id no.11、seq id no.12；探针序列为seq idno.24；
63、c.970_971del的野生型引物序列为seq id no.14、seq id no.15；探针序列为seqid no.25；
64、c.656a>g的野生型引物序列为seq id no.17、seq id no.18；探针序列为seq idno.26。
65、特别是，qpcr反应程序如下：污染消化，37℃，2min；变性：95℃，5min；“变性-延伸”反应，45次循环：①变性：95℃，10s；②延伸：60℃，30s。
66、本发明nppk基因突变分型检测试剂盒、检测方法与现有技术相比具有如下优点：
67、1、本发明的检测nppk基因突变的试剂盒及其应用为检测nppk提供了新的思路和应用方向。
68、2、本发明的用于检测nppk基因突变的试剂盒的基因突变检测位点选择合理，覆盖面广：目前已有专利基于人群数据库信息，选择基因频率较高位点作为检测位点。而本发明基于前期的中国人群大样本队列研究结果，选择了4个nppk的serpinb7始祖突变及2个serpina12常见突变作为本试剂盒的检测位点，位点选择更加合理，并且覆盖几乎全部nppk患者的基因类型，降低了漏检的几率，提高了检测效率和检测的准确性。
69、3、采用本发明试剂盒的检测方法成本低：目前已有专利利用mgb-taqman技术，探针设计于突变位点上，需要携带有mgb结构，价格昂贵，成本较高。而本发明基于as-pcr技术，引物设计于突变位点上，通过特异性引物，对野生型及突变型基因进行区分，无需特在探针上加入mgb结构，成本较低。
70、本发明试剂盒为遗传性疾病nppk基因突变的检测提供了快速、稳定、准确的检测结果，排除非遗传性因素；
71、本发明的试剂盒能够准确区别遗传性疾病nppk是由哪些或哪个基因位点突变所致，为患者提供遗传模式、子女发病率等信息；为孕妇产前筛查提供准确信息。
72、本发明的用于检测nppk基因突变的试剂盒为后续nppk病治疗药物的研发提供科学、精确的遗传学信息，根据不同的遗传突变，提供不同的治疗药物，靶向治疗。
73、目前serpinb7基因突变检测依赖于ngs+sanger测序、pcr+sanger测序。这些方法的不利之处在于设备没有普及，流程繁琐、结果分析复杂、检测成本高、普及型差。因此高效、快速、操作简便的实时荧光定量pcr成为分子诊断领域的主要方法。
1.一种用于nppk(长岛型(样)掌跖角化病)基因突变检测的试剂盒，其特征是，包括6组检测基因突变位点的引物和对应的探针，其中，所述的6组检测基因突变位点为serpinb7基因上的4个位点：c.796c>t、c.522dupt、c.650_653delctgt、c.455g>t；serpina12基因上的2个位点c.970_971del及c.656a>g。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述检测基因位点包括突变型和野生型。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述检测基因位点突变型引物、探针分别如下：
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述检测基因的突变位点的野生型引物、探针分别如下：
5.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征是，所述引物为根据检测基因的突变位点设计的实时荧光pcr扩增引物；所述探针为根据检测基因的突变位点设计的taqman探针。
6.一种如权利要求1所述的试剂盒在nppk基因突变检测中的应用。
7.一种如权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征是，包括如下步骤：
8.如权利要求7所述的应用方法，其特征是，步骤2)中实时荧光定量pcr反应过程中，qpcr反应体系如下：
9.如权利要求8所述的应用方法，其特征是，所述引物为基因突变位点的突变型、野生型引物、探针，其中所述基因位点为serpinb7基因上的4个位点：c.796c>t、c.522dupt、c.650_653delctgt、c.455g>t；serpina12基因上的2个位点c.970_971del及c.656a>g。
10.如权利要求9所述的应用方法，其特征是，所述基因突变位点突变型对应的引物、探针分别如下：
