本发明属于水产学领域，具体涉及脊尾白虾mmd2基因的克隆及脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的构建和应用。
背景技术：
1、单核细胞向巨噬细胞分化因子2(mmd2)编码孕激素和脂肪细胞受体10(paqr10)，具有古老的七次跨膜结构，属于孕激素和脂肪细胞q受体(paqr)家族的成员，在生长发育中起关键作用。paqr家族成员在脂肪酸氧化、炎症反应、代谢过程、细胞凋亡、肿瘤发生、性激素调节等方面起调控作用。目前对mmd2基因研究较少，已经确认它在抑制肌肉生长中发挥重要作用。此外，mmd2基因在影响细胞凋亡、免疫调控、神经胶质前体细胞增殖和能量代谢等诸多方面发挥着重要作用。然而，虽然已经知道mmd2基因编码paqr10蛋白，但mmd2基因在虾中的功能和调控机制尚不清楚。
2、虾类是重要的水产养殖品种，单产值高，在世界经济发展中占有重要地位。提高产量一直是虾养殖的重要目标。快速生长是提高产量的关键，可为虾养殖带来更多的经济效益和可持续发展。传统育种技术培育新品种时具有育种周期长、遗传性状难以预测等难以克服的障碍制约了其发展。基因编辑，是一种对生物体基因组特定目标基因进行精确修饰的基因工程技术，主要包括zfn、talen、crispr/cas9系统，在基因研究和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。crispr/cas9系统具有靶向特异性高、编辑效率高、细胞毒性低，成本低等特点，靶向基因组编辑可通过易出错的非同源末端连接或高保真同源重组修复途径在dna双链断裂后在诱导特定基因组位点产生突变，已经在多种陆上和水生经济物种的育种中发挥重要作用。
3、脊尾白虾主要分布于黄渤海浅海低盐水域，是我国重要的中小型经济虾类。脊尾白虾为广温、广盐、广分布性，具有生长速度快、繁殖周期短、适应能力强等优点，现已成为我国沿海地区的特色养殖品种。肌肉是脊尾白虾的主要可食用部分，占虾体组织的绝大部分。在脊尾白虾的生长过程中，肌肉的增长对其整体生长发育至关重要，不仅影响虾的外观和口感，还决定了其营养价值和市场价值。因此，对可能影响脊尾白虾肌肉生长的mmd2基因进行研究具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供脊尾白虾mmd2(ecmmd2)基因的编码序列和氨基酸序列，并首次利用crispr/cas9技术获得脊尾白虾mmd2基因缺失突变体，为研究mmd2基因的生物学功能以及甲壳动物基因编辑育种的应用提供了重要的理论基础。
2、本发明采用以下技术方案：
3、本发明首先根据脊尾白虾基因组和转录组信息提示，利用pcr扩增技术，从脊尾白虾cdna文库中克隆得到了脊尾白虾mmd2基因的核苷酸序列和氨基酸序列，所述脊尾白虾mmd2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述脊尾白虾mmd2基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、本发明还提供了一种脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，包括以下步骤：
5、s1：在上述脊尾白虾mmd2基因第三个外显子上设计三条sgrnas序列：ecmmd2-sgrna1、ecmmd2-sgrna2和ecmmd2-sgrna3；所述ecmmd2-sgrna1、ecmmd2
6、-sgrna2和ecmmd2-sgrna3的核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4和seqid no.5所示；
7、s2：以sgrna框架质粒pmd19-grna为模板，分别以ecmmd2-sgrna1-f、ecmmd2-sgrna2-f和ecmmd2-sgrna3-f为正向引物，以crispr-r为反向引物进行pcr扩增；
8、所述ecmmd2-sgrna1-f、ecmmd2-sgrna2-f和ecmmd2-sgrna3-f的序列分别如seqid no.6、seq id no.7和seq id no.8所示；所述crispr-r的序列如seq id no.9所示；
9、所述sgrna框架序列为：
10、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcg gtgctttttt，
11、将sgrna框架序列连入pmd19-t载体，即获得sgrna框架质粒pmd19-grna；
12、s3：对步骤s2的pcr扩增产物进行体外转录，并对转录得到的mrna进行纯化，得到纯化后的sgrnas序列；
13、s4：将上述纯化后的sgrnas序列和cas9蛋白混合后显微注射到脊尾白虾受精卵中；
14、s5：待脊尾白虾受精卵发育至幼虾，采用如seq id no.10和seq id no.11所示的引物序列筛选脊尾白虾mmd2基因缺失突变体。
15、进一步的，在步骤s5分别对导入sgrnas与cas9蛋白的脊尾白虾进行基因型检测，鉴定为mmd2基因敲除的纯合子即为稳定遗传的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体。
16、进一步的，步骤s2所述pcr扩增的反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃复性延伸15s，32个循环；72℃延伸7min。
17、进一步的，步骤s4所述显微注射时，注射终浓度：每个sgrna为300ng/μl、cas9蛋白为300ng/μl和0.05％的酚红。
18、本发明还提供利用上述方法制备得到的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体作为动物模型在研究mmd2基因的生物学功能中的应用。
19、本发明还提供利用上述方法制备得到的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体在甲壳动物生长表型基因编辑育种中的应用。
20、更进一步的，所述甲壳类动物为虾蟹类甲壳动物。
21、实施例表明，利用上述方法制备的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体在体长以及与肌纤维组成和生长相关的基因ecmhc2和ecmlc1的表达等方面较野生型脊尾白虾表现出更好的生长表型。
22、本发明的有益效果在于：
23、1)本发明首次确定了脊尾白虾mmd2基因的全部编码序列和部分非编码序列，并得到了其编码的氨基酸序列、结构域及其跨膜位点。发明人进一步将所述脊尾白虾mmd2基因收录在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获得其登录号为：pq085008。
24、2)本发明首次利用crispr/cas9技术获得脊尾白虾mmd2基因缺失突变体，并且该突变体相对于野生型幼体脊尾白虾具有显著的生长优势。
25、3)本发明在第一代即获得脊尾白虾mmd2基因缺失纯合突变体，与传统育种技术相比，具有操作简单、效率高、成本低、节省时间等优点，且不需要进入外源基因，降低了生物安全风险。
26、4)本发明构建的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体能用于培养获得生长快、肌肉增多的脊尾白虾，为经济甲壳动物的遗传育种奠定基础。
1.一种脊尾白虾mmd2基因，其特征在于，所述脊尾白虾mmd2基因的核苷酸序列如seqid no.1所示。
2.根据权利要求1所述的脊尾白虾mmd2基因，其特征在于，所述脊尾白虾mmd2基因编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.一种脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，在步骤s5对导入sgrnas与cas9蛋白的脊尾白虾进行基因型检测，鉴定为mmd2基因敲除的纯合子即为稳定遗传的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体。
5.根据权利要求3所述的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤s2所述pcr扩增的反应条件为：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃复性延伸15 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。
6.根据权利要求3所述的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤s2中，将所述sgrna框架序列连入pmd19-t载体，即获得sgrna框架质粒pmd19-grna。
7.根据权利要求3所述的脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤s4所述显微注射时，注射终浓度：每个sgrna为300 ng/µl、cas9蛋白为300 ng/µl和0.05 %的酚红。
8.脊尾白虾mmd2基因缺失突变体作为动物模型在研究mmd2基因的生物学功能中的应用，所述脊尾白虾mmd2基因缺失突变体通过权利要求3至7任一项所述脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法得到。
9.脊尾白虾mmd2基因缺失突变体在甲壳动物生长表型基因编辑育种中的应用，所述脊尾白虾mmd2基因缺失突变体通过权利要求3至7任一项所述脊尾白虾mmd2基因缺失突变体的制备方法得到。
