本发明涉及酶解提取多肽的方法，尤其是涉及一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法。
背景技术：
1、我国鱼类资源非常丰富，其中鱼类加工过程中的产生的下脚料很多，比如鱼鳞、鱼骨、内脏等，其中鱼骨占比很大，其主要成分是蛋白质、脂肪、水分和灰分，还含有大量的微量元素比如钙、磷等，因此鱼骨具有综合利用前景。目前主要的利用方式是：其一：加工成鱼骨粉，鱼骨粉制作的主要原料为鱼骨、鱼头、鱼皮等下脚料，经过脱腥、除臭、干燥、粉碎等操作制成，既可以作为饲料，也可以作为人体补充剂；其二，加工成多肽制剂，鱼骨上的蛋白质经过蛋白酶酶解后，形成的活性多肽具有抗氧化、降血压、预防骨质疏松、抗菌、降血糖等多种功能，在食品、保健品、生物医院等领域应用广泛。
2、目前鱼骨制备多肽的工艺一般是采用复合蛋白酶进行酶解，对于酶的需求量比较大，加工成本高，目前现有技术中采用固定化酶对鱼类下脚料进行深加工，固定化酶是通过一定方法将酶负载在基质上，形成酶-基质复合物，不仅稳定性高，还能反复回收利用，大大节省了酶解的成本。但是目前现有技术中的固定化酶的负载量和重复利用性能有限，有进一步提升的空间。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，采用固定化酶进行酶解，制备的固定化酶对酶负载量比较大，酶活收率高，而且性能稳定，能实现重复利用，能降低酶解提取活性肽的生产成本。
2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，包括以下步骤：
4、（1）称取新鲜鱼骨，浇淋液氮后粉碎成颗粒；
5、（2）颗粒和水按重量比1：10混合后，120℃蒸煮20-30min，去除上层脂肪，打浆；
6、（3）浆液中添加固定化酶进行酶解，酶解条件：ph7.5-8，温度40-50℃，固定化酶添加量为0.8-1mg/ml，时间3-4h，沸水浴灭酶后，得到的酶解液去上层脂肪，分离出的上清液经真空浓缩得活性多肽液，分离出的沉淀经洗涤干燥得高钙鱼骨粉；
7、所述固定化酶由以下步骤制备而成：
8、1）将淀粉和蒙脱土分散在水中，90-100℃下超声分散均匀，加入海藻酸钠、羟甲基纤维素钠溶液搅拌均匀，所述淀粉、蒙脱土、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠和水重量比为0.5：1-1.5：2：1：100；
9、2）将上述混合液滴入质量分数为2-4%的cacl2溶液中，交联反应1h，得到直径为1-2mm的凝胶球，冷冻10-12h，洗涤干燥后得载体；
10、3）按1：9-11重量比将载体分散在0.1-0.15g/ml蛋白酶溶液中，20-25℃振荡吸附16-20h，洗涤干燥得固定化酶。
11、进一步的，将步骤2）中制备载体浸没在ph5.4缓冲溶液中，加入淀粉量1-2%的复合淀粉酶，在50℃下搅拌反应10h，过滤后洗涤干燥，得多孔的载体。
12、进一步的，所述复合淀粉酶为α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶按重量比3-6：1混合而成。
13、进一步的，所述步骤3）中的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶按重量比1：1混合而成。
14、进一步的，所述步骤3）中的载体分散在蛋白酶溶液之前经过活化处理，具体处理步骤是：将载体按固液比1：5-8浸入ph8.5、1-2mg/ml的盐酸多巴胺的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌2-2.5h，洗涤干燥。
15、本发明的有益效果是：
16、1、本申请公开一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，为降低从鱼骨中提取活性多肽的成本，采用固定化酶进行酶解，制备的固定化酶对酶负载量比较大，酶活收率高，而且性能稳定，能实现重复利用。
17、2、本申请中的固定化酶是采用海藻酸钠和钙离子交联而成的凝胶作为骨架，另外添加的淀粉和羧甲基纤维素钠，可以与海藻酸钠以氢键的作用互穿在海藻酸钠骨架中，增加凝胶的结构强度和稳定性，另外羧甲基纤维素钠上的-ch2och2coo-的空间体积效可以增加凝胶内部空隙，增加吸附性能。另外还添加有少量的蒙脱土，蒙脱土比表面积大，吸附性能优异，蒙脱土上的硅氧键能够与海藻酸钠上的极性集团形成氢键，从而增强凝胶材料的吸附性能，增加载体对蛋白酶的负载量。
18、3、本申请在形成凝胶球后，采用淀粉酶进行酶解，能够使淀粉的无定型区发生水解，从而在载体的表面以及内部形成微孔的结构，从而增加其对蛋白酶的固定性能和吸附性能。
19、4、为进一步增加本申请的载体对蛋白酶的吸附性能，本申请在固定蛋白酶之前，对载体进行活化处理，采用的是盐酸多巴胺，在弱碱性环境中，可以聚合修饰在载体表面以及空隙表面，增加载体表面活性基团，从而增加载体对蛋白酶的负载量和稳定性。
1.一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，其特征在于：将步骤2）中制备载体浸没在ph5.4缓冲溶液中，加入淀粉量1-2%的复合淀粉酶，在50℃下搅拌反应10h，过滤后洗涤干燥，得多孔的载体。
3.根据权利要求2所述的一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，其特征在于：所述复合淀粉酶为α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶按重量比3-6：1混合而成。
4.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中的蛋白酶溶液中的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶按重量比1：1混合而成。
5.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备鱼骨活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤3）中的载体分散在蛋白酶溶液之前经过活化处理，具体处理步骤是：将载体按固液比1：5-8浸于ph8.5、1-2mg/ml的盐酸多巴胺的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌2-2.5h，洗涤干燥。
