发明涉及分子生物学和生物医学，具体来说，涉及一种钩端螺旋体数字pcr检测引物探针组合及其应用。
背景技术：
1、钩端螺旋体(leptospira)简称钩体，一种具有严重致病性的微生物。钩端螺旋体根据其致病性大致可以分为致病型、腐生型和中度型三大类。致病型钩体能引起人及动物的钩端螺旋体病(leptospirosis)，简称钩体病，鼠类及猪是主要传染源。临床表现以早期钩体败血症，中期的各器官损害和功能障碍，以及后期的各种变态反应并发症为特点，重症患者可发生肝肾功能衰竭和肺弥漫性出血，常危及生命。钩体病在世界各地广泛流行，以热带、亚热带为最多，中国绝大多数地区都有不同程度的流行，尤以南方各省较严重。不同型别的钩端螺旋体可能导致不同的临床表现和病理变化。
2、因此，对于钩端螺旋体的准确、灵敏检测以及区分其致病型、腐生型和中度型具有极其重要的意义。
3、现有的钩端螺旋体检测方法主要包括血清学方法和分子生物学方法。血清学方法主要包括elisa、免疫荧光等，这些方法需要大量的特异性抗体，且可能存在交叉反应，导致结果准确性不高。分子生物学方法主要包括常规pcr、基因测序等，这些方法需要繁琐的凝胶电泳或测序设备，且可能存在假阳性或假阴性结果。这些传统检测方法各有优点，也存在明显不足，不是十分理想的钩体检测方法。
4、数字pcr是一种继实时荧光定量pcr(real-time quantitative pcr，qpcr)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术，通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行pcr扩增，并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统pcr技术相比，数字pcr技术不依赖于标准曲线，具有更高灵敏度、准确度及高耐受性，可实现对样品的绝对定量分析。数字pcr满足对钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型准确、灵敏检测方法的需求。
5、现有数字pcr技术由于自身芯片载量的限制，反应液以及样本的上样量都会受到限制，尤其是样本的上样量，这使得数字pcr在检测核酸含量极低的样本时容易出现漏检的情况，或是需要进一步浓缩处理核酸才可以达到理想的结果。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是现有的钩端螺旋体检测方法需要大量的特异性抗体，且可能存在交叉反应、假阳性或假阴性结果等，导致结果准确性不高，提供了一种钩端螺旋体数字pcr检测技术及其专用试剂盒。利用本发明的检测技术及其专用试剂盒可以实现对钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型的快速、准确检测，具有高灵敏度和高精度性；本发明的试剂盒包含了所有必要的试剂，使用方便，可以满足实验室或现场检测的需求。
2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
3、本发明第一方面提供一种引物探针组合物，所述引物探针组合包含lil32组、16s组或secy组中的一组或多组：
4、所述lil32组由引物lil32-45f、引物lil32-286r和探针lil32-189p组成，所述引物lil32-45f具有如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述引物lil32-286r具有如seq idno:3所示的核苷酸序列，所述探针lil32-189p具有如seq id no:5所示的核苷酸序列；
5、所述16s组由引物16s-f、引物16s-r和探针16s-p组成；所述引物16s-f具有如seqid no:6所示的核苷酸序列，所述引物16s-r具有如seq id no:8所示的核苷酸序列，所述探针16s-p具有如seq id no:10所示的核苷酸序列；
6、所述secy组由引物secy-f、引物secy-r和探针secy-p组成；所述引物secy-f具有如seq id no:11所示的核苷酸序列，所述引物secy-r具有如seq id no:13所示的核苷酸序列，所述探针secy-p具有如seq id no:15所示的核苷酸序列。
7、在一些实施方案中，所述引物探针组合还包含内参组，内参组为actb组，所述actb组由引物actb-f、引物actb-r和探针actb-p组成引物；所述引物actb-f具有如seq id no:16所示的核苷酸序列，所述引物actb-r具有如seq id no:17所示的核苷酸序列，所述探针actb-p具有如seq id no:18所示的核苷酸序列。
8、在一些实施方案中，所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，且荧光报告基团的颜色不同。
9、在一些实施方案中，所述荧光报告基团选自fam、hex、rox、670、vic、joe、tet、cy3、cy5、texas red或lc red460。
10、在一些实施方案中，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl或eclipse。
11、在一些实施方案中，所述探针的5'修饰有荧光报告基团。
12、在一些实施方案中，所述探针的3'修饰有荧光淬灭基团。
13、本发明第二方面提供一种试剂盒，试剂盒包括如本发明第一方面所述的引物探针组合。
14、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括缓冲液、氯化镁、dntp和dna聚合酶中的一种或多种。
15、在一些具体的实施方案中，所述引物探针组合与缓冲液、氯化镁和dntp形成反应液ⅰ，所述dna聚合酶为反应液ⅱ；反应液i和反应液ii以冻干形式存在。
16、在一些具体的实施方案中，试剂盒用于数字pcr。
17、本发明第三方面提供一种检测剂，所述检测剂包含如本发明第一方面所述的引物探针组合或上述的试剂盒。
18、本发明第四方面提供如本发明第一方面所述的引物探针组合、上述的试剂盒或上述的检测剂在制备检测样本中钩端螺旋体的产品中的应用。
19、在一些实施方案中，所述检测样本中钩端螺旋体为检测样本中是否含有钩端螺旋体。
20、在一些实施方案中，所述检测样本中钩端螺旋体为检测样本中的钩端螺旋体是否为致病型、腐生型和中度型中的一种或多种。
21、本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的引物探针组合、如本发明第二方面所述的试剂盒或如本发明第三方面所述的检测剂在检测样本中的钩端螺旋体中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的。
22、在一些实施方案中，所述检测样本中的钩端螺旋体为检测样本中是否含有钩端螺旋体。
23、在一些实施方案中，所述检测样本中的钩端螺旋体为检测样本中的钩端螺旋体是否为致病型、腐生型和中度型中的一种或多种。
24、本发明第六方面提供一种检测待测样本中钩端螺旋体的方法，所述方法包括如下步骤：
25、1)提取待测样品的dna；
26、2)采用如本发明第一方面所述的引物探针组合、如本发明第二方面所述的试剂盒或如本发明第三方面所述的检测剂进行数字pcr；
27、3)根据数字pcr反应得到的阳性液滴，确定样本中是否含有钩端螺旋体；
28、所述方法为非疾病诊断和治疗目的的。
29、在一些实施方案中，步骤3)中根据数字pcr反应得到的阳性液滴，确定样本中的钩端螺旋体是否为致病型、腐生型和中度型中的一种或多种。
30、本发明的钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型多重数字pcr检测技术在临床上的应用可以概括为以下两个方面：
31、1、用于疾病诊断：对于钩端螺旋体感染的患者，通过本发明的多重数字pcr检测技术可以快速准确地检测出致病型、腐生型和中度型的钩端螺旋体，从而帮助医生确定病情并制定相应的治疗方案。
32、2、用于流行病学调查：通过本发明的多重数字pcr检测技术对钩端螺旋体感染的地区和人群进行调查和分析，可以有效地掌握钩端螺旋体的流行趋势和传播特点，为相关预防和控制工作提供科学依据。
33、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
34、本发明所用试剂和原料均市售可得。
35、本发明的积极进步效果在于：
36、本发明的方法及试剂盒开辟了钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型检测的新途径，利用敏感性、特异性以及实用性、经济性，建立了钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型检测方法；实现了对钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型的快速、准确检测，具有高灵敏度和高精度性。
37、本发明的试剂盒采用了标准化的设计，方便携带和使用；试剂盒包含了所有必要的试剂，使用方便，可以满足实验室或现场检测的需求；试剂盒包含了用于质量控制的标准品，可以保证检测结果的可靠性；实现了钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型检测技术商品化，有力促进钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型监测水平的全面提高，推动了钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型防控工作。
38、本发明的钩端螺旋体致病型、腐生型和中度型多重数字pcr检测技术具有较大的改进和应用拓展空间。例如，可以进一步改进双重数字pcr技术，提高其灵敏度和准确性；可以将其应用于其他类似病原体检测中，如其他致病微生物的检测；可以将其与免疫学方法、生物信息学方法等其他技术结合使用，形成更加完善的检测体系。
1.一种引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包含lil32组、16s组和secy组中的一组或多组；
2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包含内参组，内参组为actb组，所述actb组由引物actb-f、引物actb-r和探针actb-p组成引物；所述引物actb-f具有如seq id no:16所示的核苷酸序列，所述引物actb-r具有如seq id no:17所示的核苷酸序列，所述探针actb-p具有如seq id no:18所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，且荧光报告基团的颜色不同；优选地，所述荧光报告基团选自fam、hex、rox、670、vic、joe、tet、cy3、cy5、texas red或lc red460；和/或，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl或eclipse；和/或，所述探针的5'修饰有荧光报告基团；和/或，所述探针的3'修饰有荧光淬灭基团。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合；
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合与缓冲液、氯化镁和dntp形成反应液ⅰ，所述dna聚合酶为反应液ⅱ；反应液i和反应液ii以冻干形式存在。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于数字pcr。
7.一种检测剂，其特征在于，所述检测剂包含如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合或如权利要求4-6任一项所述的试剂盒。
8.如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合、权利要求4-6任一项所述的试剂盒或如权利要求7所述的检测剂在制备检测样本中钩端螺旋体的产品中的应用；
9.如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合、如权利要求4-6任一项所述的试剂盒或如权利要求7所述的检测剂在检测样本中的钩端螺旋体中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的；
10.一种检测待测样本中钩端螺旋体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
