本发明涉及α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
背景技术：
1、α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
2、α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些用途如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
3、属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作特妙淀粉酶(termamyl)，所述特妙淀粉酶已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。芽孢杆菌属淀粉酶(如特妙淀粉酶和sp707)形成一个特定组的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以便改进它们在特定应用中的功能性。
4、已经充分研究了增加α-淀粉酶热稳定性的方法。铃木(suzuki)等人(1989)披露了其中已经将解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的指定区域置换为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域的嵌合α-淀粉酶。构建这种嵌合α-淀粉酶，目的在于鉴定负责热稳定性的区域。发现这类区域包含解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的第177-186位氨基酸残基和第255-270位氨基酸残基。五十岚(igarashi)等人1998显示可以通过从环(f178至a184)中缺失两个氨基酸残基r179-g180(amys编号)而增加amys-型淀粉酶的热稳定性。然而，晓(shiau)等人(2003)显示在相同环中具有缺失的amys酶在高温具有比亲本酶更低的玉米淀粉水解比活性，从而否定了amys淀粉酶的主要优点之一。
5、出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有通常在低温洗涤中所用温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以彻底去除的许多污渍。这些问题因利用低(例如，冷水)洗涤温度的增加和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下起作用并同时保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。
6、因而，本发明的目的在于提供以下α-淀粉酶变体:在低温下具有高性能特别是高洗涤性能的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂组合物中具有高稳定性的α-淀粉酶变体和/或在洗涤剂中存储后具有高淀粉酶活性的α-淀粉酶变体。
7、本发明的另一个目的在于提供以下α-淀粉酶变体：在掺入洗涤剂组合物如液体洗涤剂中时,特别是在螯合剂、表面活性剂、蛋白酶和/或碱性条件的存在下，该α-淀粉酶变体展示出高水平稳定性。
8、本发明提供了与其亲本相比具有改进的稳定性的α-淀粉酶变体。
技术实现思路
1、本发明涉及一种分离的α-淀粉酶变体，该α-淀粉酶变体包括a)在对应于seq idno:1或2的成熟多肽的位置r180、s181、t182和g183的两个或更多个位置处的缺失，以及b)在对应于seq id no:1或2的成熟多肽的位置y48、e169、s170、r171、k172、l173、n174、l205、r309、m317、i390的一个或多个位置处的改变，其中每个改变独立地是取代或插入并且其中该变体与seq id no:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
2、本发明还涉及包含这些变体的洗涤剂组合物，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
3、本发明还涉及这些变体在清洁过程中的用途。
4、本发明还涉及通过向亲本α-淀粉酶引入以下各项而改进α-淀粉酶的洗涤剂稳定性的方法：a)在对应于seq id no:1或2的成熟多肽的位置r180、s181、t182和g183的两个或更多个位置处的缺失，以及b)
5、在对应于seq id no:1或2的成熟多肽的位置y48、e169、s170、r171、k172、l173、n174、l205、r309、m317、i390的一个或多个位置处的改变，
6、其中每个改变独立地是取代或插入，其中所得变体与seq id no:1或2的成熟多肽具有至少80％，例如至少90％，但小于100％的序列一致性，其中该所得变体具有α-淀粉酶活性并且与该亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤剂稳定性。
7、定义
8、α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(e.c.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据方法中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有seq id no:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
9、seq id no:1：
10、
11、seq id no:2：
12、
13、等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
14、cdna：术语“cdna”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。早先的初始rna转录本是mrna的前体，其在呈现为成熟的剪接的mrna之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
15、编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如atg、gtg或ttg)开始并且以一个终止密码子(如taa、tag或tga)结束。编码序列可以是一种基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
16、控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
17、表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
18、表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状dna分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
19、片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽。其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一个片段包含至少480个氨基酸残基、至少481个氨基酸残基或至少482个氨基酸残基。
20、高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％ sds，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
21、宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
22、改进的特性：术语“改进的特性”意指一种与变体相关的特征，该特征相比于亲本或相比于seq id no:1或2的成熟多肽得到了改进。此类改进的特性包括但不限于催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、ph活性、ph稳定性、比活性、存储条件下稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性以及热稳定性和改进的洗涤性能，特别是在低温下，例如5℃与35℃之间的温度，例如低于35℃或低于30℃或甚至低于20℃，或在低于15℃的温度下，或甚至在低于10℃的温度下的改进的洗涤性能。可以在这些变体中改进的另一种特性是在洗涤剂组合物中的稳定性，即洗涤剂稳定性。给定变体的洗涤剂稳定性(或残余活性)可以通过在洗涤剂标准溶液中孵育该变体来确定，该洗涤剂标准溶液优选包含螯合剂例如edta、egta、dtpa、dtmpa、mgda或hedp。例如，将包含dtmpa(终浓度0.2％)的90vol％的标准洗涤剂a(见下文)与10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)在40℃下孵育1小时。作为另一个实例，将还包含hedp(终浓度1.5％)的90vol％的标准洗涤剂a(见下文)与10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)在37℃下孵育2小时。确定在给定温度下孵育给定时间段后的淀粉酶活性，举例来说，通过使用如下所述的enzchek测定来确定。然后将此活性与在相同洗涤剂组合物中在4℃下孵育相同时间段的参照的活性进行比较。作为另一个实例，用10vol％淀粉酶溶液(0.6mg/ml)孵育还包含另外的终浓度为0.5％(w/v)的edta的90％终浓度的洗涤剂a。确定在给定温度下孵育给定时间段后的淀粉酶活性，举例来说，通过使用如下所述的phadebas测定来确定。然后将此活性与在相同洗涤剂组合物中在4℃下孵育相同时间段的参照的活性进行比较。
23、在两种处理之间的差异越少，洗涤剂稳定性越高。使用包含螯合剂的标准洗涤剂j或其他洗涤剂可以进行相似测试。
24、洗涤性能：在本发明背景下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(δrem)量化洗涤性能。
25、改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为变体酶例如通过增加的污渍去除而相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于具有示于seq id no 1或2中的氨基酸序列的α-淀粉酶展现出淀粉酶变体的洗涤性能的改变。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。可以通过比较如在于此的定义中描述的所谓的δ反射值(δrem)测量改进的洗涤性能。
26、低温：“低温”是5℃-35℃，优选5℃-30℃更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃并且特别是5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃，更优选10℃-25℃，最优选10℃-20℃，并且特别是10℃-15℃的温度。
27、δ反射值(delta remission value，δrem)：在此将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为测试材料在460nm处的反射率或反射测量值的结果，该测试材料是例如小块布样cs-28(测试材料bv中心(center for testmaterials bv)，邮政信箱120，3133kt弗拉尔丁恩(vlaardingen)，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的至少一个其他小块布样一起测量，该其他小块布样是在相同条件下洗涤的。δ反射是用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的反射值。
28、分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质上相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质上相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
29、低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％ sds，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
30、成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是seqid no:1的氨基酸1至583。在另一方面，该多肽具有c-末端cbm的截短，这样使得该成熟多肽意指对应于seq id no:2的seq id no:1的氨基酸1-484。
31、本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。
32、成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
33、中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％ sds，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
34、中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％ sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％sds，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
35、突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。
36、核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
37、可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
38、亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行改变以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。
39、序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
40、出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)，赖斯(rice)等人，2000，遗传学趋势(trends genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德尔曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物学杂志(j.mol.biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
41、(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
42、出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
43、(一致的脱氧核糖核酸核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
44、变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有seq id no:1或2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。
45、非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％sds，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
46、非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5x sspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2x ssc、0.2％sds，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
47、野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母或丝状真菌)表达的一种α-淀粉酶。
48、变体命名惯例
49、出于本发明的目的，将seq id no:1中披露的成熟多肽用来确定另一种α-淀粉酶中的对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与seq id no:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)，赖斯(rice)等人，2000，遗传学趋势(trends genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(needleman-wunsch)算法(needleman(尼德尔曼)和wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(j.mol.biol.)48:443-453)来确定对应于seq id no:1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。
50、可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于muscle(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(edgar)，2004，核酸研究(nucleicacids research)32:1792-1797)、mafft(版本6.857或更新版本；加藤(katoh)和库马(kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(toh)，2007，生物信息学(bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(methods in molecular biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用clustalw(1.83或更新版本；汤姆斯(thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的emboss emma。
51、当其他酶与seq id no:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(lindahl)和埃洛弗松(elofsson)，2000，分子生物学杂志(j.mol.biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(atschul)等人，1997，核酸研究(nucleic acids res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如genthreader(琼斯(jones)，1999，分子生物学杂志(j.mol.biol.)287:797-815；麦古芬(mcguffin)和琼斯，2003，生物信息学(bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(gough)等人，2000，分子生物学杂志(j.mol.biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
52、对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(holm)和桑德(sander)，1998，蛋白质(proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(shindyalov)和伯恩(bourne)，1998，蛋白质工程(proteinengineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(park)，2000，生物信息学(bioinformatics)16:566-567)。
53、在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的iupac单字母或三字母氨基酸缩写。
54、取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或者“t226a”。在给定位置处的氨基酸可以用任何其他氨基酸取代的情况下，将其表示为t226acdefghiklmnpqrswvy。因此，这意味着位置226处的苏氨酸可以被选自a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、w、v或y的组的一个氨基酸取代。同样地，在给定位置处的氨基酸可以用选自特定的氨基酸组的一个氨基酸取代的情况下，例如在位置226处的苏氨酸可以被酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸中的任一个取代的情况下，将其表示为t226yfh。给定位置处的不同改变还可以由一个逗号分开，例如“arg170tyr,glu”或“r170y,e”代表位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”命名了以下变体：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”以及“tyr167ala+arg170ala”。
55、多个突变由加号(“+”)分开，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(g)被精氨酸(r)取代，并且丝氨酸(s)被苯丙氨酸(f)取代。
56、缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“gly195*”或“g195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。
57、插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“gly195glylys”或“g195gk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“glyl95glylysala”或“g195gka”。
58、在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
59、 <![cdata[<u>亲本：</u>]]> <![cdata[<u>变体：</u>]]> 195 195 195a 195b g g-k-a
60、多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“arg170tyr+gly195glu”或者“r170y+g195e”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
1.一种α-淀粉酶变体，包括
2.如权利要求1所述的变体，其中该改变b)是选自以下各项中的一个或多个：y48w、y48f、e169eq、s170sl、r171rr、r171rq、r171rl、r171rn、r171rf、k172ka、k172kf、k172kl、k172kn、k172kr、l173lr、l173lf、l173ll、l173la、n174nq、n174nf、n174nl、n174na、n174nn、n174ns、l205f、l205y、l205i、r309q、m317f、m317i、m317l、m317v、m317y、i390e、i390d、i390q、i390n、n194f+l205y、n194f+l205f、n194y+l205y、n194y+l205f、y48w+l205y、v60a+l205y、y48w+v60a+l205f、y48w+v60a+l205y。
3.如权利要求1或2所述的变体，其中该改变b)包括选自以下清单的取代或由其组成，该清单由以下各项组成：l205y、l205f、y48w、r309q、m317l；或包括选自以下清单的插入或由其组成，该清单由以下各项组成：n174nq、n174nl和n174nn。
4.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该缺失a)选自以下清单，该清单由以下各项组成：r180*+s181*、r180*+t182*、r180*+g183*、s181*+t182*、s181*+g183*、和t182*+g183*，优选r180*+s181*。
5.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该缺失a)和改变b)选自以下清单，该清单由以下各项组成：l205y+r180*+s181*、l205y+r180*+t182*、l205y+r180*+g183*、l205y+s181*+t182*、l205y+t182*+g183*、l205f+r180*+s181*、l205f+r180*+t182*、l205f+r180*+g183*、l205f+s181*+t182*、l205f+t182*+g183*、y48w+r180*+s181*、y48w+r180*+t182*、y48w+r180*+g183*、y48w+s181*+t182*、y48w+t182*+g183*、r309q+r180*+s181*、r309q+r180*+t182*、r309q+r180*+g183*、r309q+s181*+t182*、r309q+t182*+g183*、m317l+r180*+s181*、m317l+r180*+t182*、m317l+r180*+g183*、m317l+s181*+t182*、m317l+t182*+g183*、n174nq+r180*+s181*、n174nq+r180*+t182*、n174nq+r180*+g183*、n174nq+s181*+t182*、n174nq+t182*+g183*、n174nn+r180*+s181*、n174nn+r180*+t182*、n174nn+r180*+g183*、n174nn+s181*+t182*、n174nn+t182*+g183*、n174nl+r180*+s181*、n174nl+r180*+t182*、n174nl+r180*+g183*、n174nl+s181*+t182*、n174nl+t182*+g183*、n174na+r180*+s181*、n174na+r180*+t182*、n174na+r180*+g183*、n174na+s181*+t182*、n174na+t182*+g183*、y48w+l205y+r180*+s181*、y48w+l205y+r180*+t182*、y48w+l205y+r180*+g183*、y48w+l205y+s181*+t182*、y48w+l205y+t182*+g183*、v60a+l205y+r180*+s181*、v60a+l205y+r180*+t182*、v60a+l205y+r180*+g183*、v60a+l205y+s181*+t182*、v60a+l205y+t182*+g183*、y48w+v60a+l205y+r180*+s181*、y48w+v60a+l205y+r180*+t182*、y48w+v60a+l205y+r180*+g183*、y48w+v60a+l205y+s181*+t182*、y48w+v60a+l205y+t182*+g183*、i390e+r180*+s181*、i390e+r180*+t182*、i390e+r180*+g183*、i390e+s181*+t182*、i390e+t182*+g183*、e169eq+r180*+s181*、e169eq+r180*+t182*、e169eq+r180*+g183*、e169eq+s181*+t182*、和e169eq+t182*+g183*。
6.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体还包括在相应于seq id no:1或2的成熟多肽的位置g475和s243的一个或两个位置处的取代，优选g475k和/或s243q。
7.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该改变b)是所述位置中的两个或更多个，例如所述位置中的三个或更多个、所述位置中的四个或更多个、所述位置中的五个或更多个、所述位置中的六个或更多个、所述位置中的七个或更多个、所述位置中的八个或更多个、或所述位置中的九个或更多个。
8.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中改变的数目是2-20个，例如，2-10个和2-5个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
9.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。
10.如以上权利要求中任一项所述的变体，该变体与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列一致性。
