本发明涉及微生物发酵 ，尤其涉及一种连续发酵产pha的方法。
背景技术：
1、盐单胞菌halomonas sp.是分离自新疆艾丁盐湖的一类中度嗜盐菌，其最适生长盐浓度为6%，最适宜生长ph为9.0，并且在生长过程中会消耗大量葡萄糖合成pha，目前已成为发酵产pha的优势菌株。
2、以盐单胞菌发酵生产pha所采取的发酵方式主要是整个发酵周期（24~48小时）中每小时检测残糖浓度，以10g/l为参考浓度，糖浓度过高时停止补糖，糖浓度过低时补至10g/l左右的方式进行发酵。在发酵完成结束后，可积累90 g/l以上细胞干重，80%wt 以上的pha含量。
3、虽然微生物在个体层面理论上可以无限分裂，但在经过一定次数（20~40代）的分裂后，细胞的生长和增殖能力会严重下降，具体表现为菌群老化，活力不足，无法支持长期（大于等于96小时，即远超常规发酵周期）的菌群生长分裂。目前采取的发酵方案往往在发酵的底料中添加一定量的尿素，再在发酵过程中补加少量尿素和大量葡萄糖来促进微生物的生长，整体使用一罐法完成完整周期的发酵，发酵时长在24~48小时左右。
4、在现有工艺条件下，如果使用连续发酵对盐单胞菌进行培养，会导致细胞分裂速率降低，整体发酵产量及效率不如传统的一罐法发酵工艺，因此，有待提出切实可行的以盐单胞菌连续发酵产pha的改进方案。
技术实现思路
1、为解决现有方案连续发酵时间较长（>72小时）后出现嗜盐菌菌株分裂活性不足，代谢紊乱导致产量降低的问题，本发明提出了一种新的改进方案。
2、具体而言，本发明提供了一种连续发酵产pha的方法，该方法以盐单胞菌为基础菌株，通过阻断压力响应关键基因uspa的正常表达，进行连续发酵产pha；
3、所述压力响应关键基因uspa的核苷酸序列包括seq id no.1，或其功能片段。
4、seq id no.1：
5、atgagctatcaccacatattagtagccgttgatctaactaaagactcccataaaatcttagagcgcgcagtcgcgattgctgagcgcaacaacgatgccaaaatttctattatgcacaccctcgaaccattgggcttcgcttacggcggcgacattccaatggatctcaccagcattcaagaccaactggatgaccacgcaaaaaagcggctggctgaaattgccatccctcatgtcgaacctgcggatcaacatgtcgtggtcggtatgccagacaccgagattcaccgcttcgcagaagaacacaacgtcgatctaatcgttgttggctcgcatgggcgtcatggctttgccctgctacttggctctacctctaccggcgtacttcacggcgcgcagtgtgacgttttggccgttagggtcggcaaaaaaggtgaacagagcgacgagta。
6、本发明所提及的pha是指聚羟基脂肪酸酯，其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数，本发明的pha包括但不限于短链pha（即，单体为c3-c5的羟基脂肪酸）和中长链pha（即，单体为c6-c16的羟基脂肪酸）。
7、在本发明的一些实施方式中，pha可以是均聚物，包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等等，例如，聚-3-羟基丁酸酯（p3hb）、聚-4-羟基丁酸酯（p4hb）、聚-3-羟基丙酸酯（p3hp）或聚-3-羟基戊酸酯（p3hv）等。
8、在本发明的一些实施方式中，pha可以是包括但不限于共聚物如二聚物、三聚物等，例如，共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物；羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等。
9、更具体地，在本发明的一些实施方式中，pha可以是聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯（p3hb4hb）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（p3hb3hv）或聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（p34hb3hv）、或其组合等。
10、本发明所述盐单胞菌优选为halomonas。
11、更优选地，所述盐单胞菌选自halomonas bluephagenesis td01（保藏号为cgmccno. 4353）、halomonas campaniensis ls21（保藏号为cgmcc no. 659）、halomonasbluephagenesis wzy254及它们衍生菌株或其组合，更优选为halomonas bluephagenesistd01（保藏号为cgmcc no. 4353）。
12、其中，盐单胞菌halomonas bluephagenesis td01，该菌株于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为cgmccno.4353，分类命名为盐单胞菌halomonas sp. td01（也称为halomonas bluephagenesis td01；同时记载于公开号为cn102120973a的专利申请文件中，公众可以从清华大学获得该菌。
13、盐单胞菌halomonas campaniensis ls21：是成功筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，具有非常好的工业化生产应用前景，公开于“jiang x,yao z,chen gq.controlling cell volume for efficient phb production by halomonas[j].metabolic engineering,2017,44:30-37”一文，同时记载于公开号为cn118325982a的专利申请文件中，公众可以从清华大学获得该菌。
14、halomonasbluephagenesiswzy254：是已经成功实现pha工业化生产的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，公开于“wang,z.,et al.,engineering the permeability of halomonasbluephagenesis enhanced its chassis properties.metab eng,2021.67:p.53-66.”一文，同时记载于公开号为cn118325982a的专利申请文件中，公众可以从清华大学获得该菌。
15、在本发明所提供的方法中，微生物通过阻断压力响应关键基因uspa的正常表达，使得细胞不会受已凋亡细胞的影响减缓生长。但是嗜盐菌菌株在快速生长过程中会裂解出胞内溶物结合培养基底料中物质发生化学反应攻击细胞膜，而非通过生物过程，此时阻断uspa的作用不再起效果，因此发酵过程必须采用过程尿素控制较低的连续发酵方案实现。
16、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，所述连续发酵过程在氮源浓度不高于0.6g/l的条件下进行（以n含量计），以尿素为例，其在培养基中的浓度不高于1.5g/l（0-1.5g/l）。
17、本发明用于培养嗜盐微生物的mm培养基的具体配方如下：
18、尿素0.5g/l；mgso40.2g/l；kh2po41.5g/l；以及合计<0.1g/l的fe(iii)-nh4-citrate，cacl2·2h2o，znso4·7h2o，mncl2·4h2o，h3bo3，cocl2·6h2o，cuso4·5h2o，nicl2·6h2o，namoo4·2h2o。
19、在本发明提供的一些实施方式中，以前述的mm培养基作为基础培养基，并添加葡萄糖20g/l和氯化钠10g/l，进行发酵罐实验，发酵罐使用7l的发酵罐，发酵液体积3 l，ph设定在9.0，温度保持在37℃。
20、嗜盐菌发酵的一大优势在于，其可以进行开放式发酵而无需额外灭菌，同时，发酵过程中不需要加各类空气滤膜和复杂的无菌操作来减少染菌的可能性，大大节约了生产成本以及人力物力。常规的开放式发酵依托于高盐高ph的环境，以抑制其他的杂菌生长，向培养基中另外添加葡萄糖30g/l作为碳源，添加5-100g/l 氯化钠以提供嗜盐菌生长所需的渗透压环境；并将ph调节在9.0。
21、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，采用三个等体积的发酵罐（编号为发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3）进行连续发酵，具体步骤包括：
22、（1）将发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3以管道（优选为软管）串联并设置蠕动泵驱动发酵液在罐间流动；
23、（2）向发酵罐1中加入基础培养基，将盐单胞菌种子液接种于发酵罐1中，待od600值高于15，且葡萄糖浓度在10 g/l±1 g/l时，将发酵罐1中50%-60%的发酵液泵入发酵罐2中，同时向发酵罐1中添加所述基础培养基，定容到发酵初始体积；
24、（3）向发酵罐2泵入发酵罐1中发酵液的同时向其中流加料1和料2，料1、料2的流速根据含糖量（不低于9-15g/l）来调整，待od600值高于90时，将发酵罐2中的发酵液泵入发酵罐3；
25、（4）向发酵罐3泵入发酵罐2中发酵液的同时向其中流加料3（纯糖），待od600值高于300时，收集从发酵罐3泵出的发酵液，同时开始向发酵罐1持续添加所述料1以保持三个发酵罐发酵液体积动态平衡。
26、其中，所述料1包含：葡萄糖浓度700~800g/l，尿素1~5g/l（余量为水）；所述料2包含葡萄糖浓度700~800g/l，尿素0~2g/l（余量为水）；所述料3为浓度700~800g/l的葡萄糖溶液。
27、在一些方法的实例中，整个发酵过程控制发酵液中的含糖量为9～15g/l，优选10~12 g/l。
28、在一些方法的实例中，在发酵液中的含糖量降至低于9~15g/l时（优选10~12 g/l），流加料1、料2进行补料。具体而言，在发酵液中的含糖量低于9~15g/l时，流加料1、料2进行补料；优选所述料1的体积是所述基础培养基体积的5~15%；在料1消耗结束后流加料2。
29、优选地，所述基础培养基包含：葡萄糖15~35 g/l ；氯化钠20~45 g/l ；尿素2~5g/l；磷酸二氢钾4~6 g/l；硫酸镁0.01~0.2 g/l；柠檬酸铁铵5 g/l；氯化钙2 g/l；浓盐酸41.7 ml/l；七水硫酸锌100 mg/l；四水氯化锰30 mg/l ；硼酸300 mg/l；六水氯化钴200mg/l；无水硫酸铜10 mg/l；六水氯化镍20 mg/l；二水钼酸钠30 mg/l。
30、在一些方法的实例中，盐单胞菌种子液的接种量与基础培养基的体积比为3：27至4：26。
31、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，实时监测发酵罐3中发酵液的od600值，当发酵液的od600值持续降低时，停止发酵。
32、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，整个发酵过程是连续发酵的过程，发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中的发酵液体积均基本不发生变化，一直保持动态平衡，通过设置蠕动泵的转速来调节发酵液的泵出流速，使每个发酵罐中的发酵液体积保持一致。
33、优选地，各泵速均以0.05~0.8l/h为宜。
34、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，为保障发酵效果，优选发酵罐1、2、3中的温度为37℃±0.5℃。
35、优选地，发酵罐1、2、3中的搅拌转速为200~800 rmp（与溶氧相关联），优选300~600rmp，以更好地保障体系的均一性进而提高发酵效率。
36、优选地，发酵罐1、2、3中的ph值为9.0±0.1，ph调节剂选用5~7mol/l（优选6mol/l）的 naoh水溶液为宜；在上述ph范围内，更加有利于盐单胞菌的生长。
37、优选地，发酵罐1、2、3中的初始溶氧值为100%。
38、优选地，发酵罐1、2、3的体积大小均一致。
39、本发明所提供的连续发酵产pha的方法，优选进一步包括制备盐单胞菌种子液的步骤，具体包括：
40、（1）制备lb60液体培养基
41、将60 g/l的氯化钠、10 g/l的蛋白胨（英国oxid公司）、5 g/l的酵母提取物（英国oxid公司）充分溶解，用6mol/lnaoh溶液调节ph至8.5±0.05。
42、（2）制备lb60固体培养基
43、将60 g/l的氯化钠、10 g/l的蛋白胨（英国oxid公司）、5 g/l的酵母提取物（英国oxid公司）充分溶解，用6mol/lnaoh溶液调节ph至8.5±0.05，加入适量琼脂粉，搅拌均匀后于121℃下高温高压灭菌20min得到lb60固体培养基。
44、（3）制备种子液
45、步骤a，取保存与-80℃的盐单胞菌甘油管，划线接种至lb60固体培养基上，37℃下培养24h；
46、步骤b，从步骤a的lb60固体培养基上挑取盐单胞菌重新划线接种至lb60固体培养基上，37℃下培养24h；
47、步骤c，从上一步骤b的lb60固体培养基上挑取盐单胞菌接种至盛有20ml lb60液体培养基的100ml三角瓶中，37℃下、200 rpm震荡培养10-12h，得到一级种子液；
48、步骤d，取步骤c中种子液，按1%的比例接种至100ml lb60液体培养基的100ml三角瓶中，37℃下、200 rpm震荡培养8-10h，得到二级种子液，即盐单胞菌种子液；
49、在一些方法的实例中，所述发酵液需在发酵结束后进行细胞干重分析。
50、在一些方法的实例中，对发酵液真空冷冻干燥样品进行pha含量分析检测。
51、大肠杆菌生长在lb培养基上，培养基成分配置含有：10 g/l的氯化钠，10 g/l的蛋白胨（英国oxid公司，产品目录号lp0042），5 g/l的酵母提取物（英国oxid公司，产品目录号lp0021）。
52、盐单胞菌halomonas bluephagenesis td01在lb60的培养基上培养，其成分除氯化钠的浓度变成60g/l外其它成分同lb一样。
53、本发明的有益效果至少包括：
54、（1）本发明以盐单胞菌三段式连续发酵获得pha，此类菌能适应高盐浓度的培养基，进而避免了发酵罐中的培养基被空气中的杂菌污染，确保了嗜盐单胞菌的纯种培养；
55、（2）采用三段式连续发酵，盐单胞菌体的增殖过程主要发生在发酵罐1中，菌体增殖向pha合成转变的过程主要发生在发酵罐2中，pha快速合成积累的过程主要发生在发酵罐3中，整个发酵过程可持续进行120h左右，延长了单次发酵的时间，产能得到大大提高；相较于分批发酵，不易被杂菌污染，菌种不易老化，消除各阶段代谢有毒产物对发酵的影响，产能较高；且可以解除底物抑制，并能控制适当的菌体浓度，底物转化率较高。
56、（3）本发明可显著降低种子液制备成本，缩短发酵罐清洗时间及频次，提升发酵效率，提高产能，具有极好的推广前景。
1.一种连续发酵产pha的方法，其特征在于，以盐单胞菌为基础菌株，通过阻断压力响应关键基因uspa的正常表达，进行连续发酵产pha；
2.根据权利要求1所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，所述盐单胞菌为halomonas；
3.根据权利要求1或2所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，所述连续发酵过程在氮源浓度不高于0.6g/l的条件下进行。
4.根据权利要求1~3任一项所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，采用三个等体积的发酵罐进行连续发酵，包括：
5.根据权利要求4所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，整个发酵过程控制发酵液中的含糖量为9～15g/l，优选10~12 g/l。
6.根据权利要求5所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，在发酵液中的含糖量低于9~15g/l时，流加料1、料2进行补料；优选所述料1的体积是所述基础培养基体积的5~15%；在料1消耗结束后流加料2。
7.根据权利要求4~6任一项所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，所述盐单胞菌种子液的接种量与基础培养基的体积比为3：27至4：26。
8.根据权利要求4~7任一项所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，当发酵罐3中发酵液的od600值持续降低时，停止发酵。
9.根据权利要求1~8任一项所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，发酵罐1、2、3中的温度为37℃±0.5℃；和/或，发酵罐1、2、3中的搅拌转速为200~800 rmp；和/或，发酵罐1、2、3中的ph值为9.0±0.1。
10.根据权利要求1~9任一项所述的连续发酵产pha的方法，其特征在于，发酵罐1、2、3中的初始溶氧值为100%。
