本公开涉及shrna表达框、携带其的多核苷酸序列及其应用，属于生物技术和基因治疗领域。
背景技术：
1、小干扰rna(small interfering rna；sirna)有时称为短干扰rna(shortinterfering rna)或沉默rna(silencing rna)，是一个长20到25个核苷酸的双股rna，在生物学上有许多不同的用途。将针对靶基因的sirna设计成发夹结构送入体内时，该发夹结构表达形成shrna，shrna是short hairpin rna的缩写，翻译为“短发夹rna”，shrna包括两个短反向重复序列。目前已知shrna主要参与rna干扰(rnai)现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与rnai相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。shrna进入细胞后，被宿主细胞内rna解旋酶解旋为正义rna链与反义rna链，反义rna链与体内的一些酶结合成沉默复合物risc，识别含有其互补序列的mrna，并与之结合。此时的risc具有核酸酶的功能，能够切割降解mrna，从而抑制相应基因表达的现象称为rna干扰(rna interference,rnai)。
2、shrna特点包括基因序列特异性、高效性和可遗传性。体外合成shrna进入细胞后容易降解，半衰期短。很难穿透细胞膜及血管内皮，转染效率有限。且进入细胞shrna的量不受控制，容易在脾脏堆积。需要有效的媒介或递送途径将外源shrna递送到生物体内。一种方法是利用化学修饰的方法直接递送，如脂质体转染、peg修饰，无需克隆到载体即可将shrna直接导入细胞抑制特定基因的表达。与直接使用shrna表达框相比，质粒或病毒类载体介导的shrna体内表达的方法显示了其优势。将shrna对应的dsrna序列克隆到含有适合启动子的质粒载体或病毒载体中，再用质粒转染细胞或用病毒感染细胞，在启动子的操纵下转录生成所需的shrna，在体内法可持续产生sirna作用。
3、腺相关病毒(aav)属微小病毒(parvovirus)家族的成员，为无包膜的单链线状dna病毒，作为基因治疗载体，具有非常多的优势。如感染效率高，感染范围广，长期表达的高安全性等。临床中用于治疗肿瘤、视网膜疾病、关节炎、艾滋病、心力衰竭、肌营养不良症、神经系统疾病及其它一系列基因缺陷疾病。但因本公开中涉及的shrna长度很短，只有几十个bp，当使用aav病毒载体表达时，包装效率和表达量均为难题之一。
技术实现思路
1、本公开的部分实施例是提供一种shrna表达框、携带该shrna表达框的多核苷酸序列、携带该多核苷酸序列的重组载体质粒、shrna、宿主、病毒颗粒、分离的改造的细胞、药物组合物、它们在制备预防和治疗乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征、治疗duchenne型肌营养不良症(dmd)、治疗高胆固醇血症等的药物中的应用、以及重组载体质粒的载体制备系统。
2、本公开的表达框采用填充序列进行扩充且使得表达框序列长度接近野生型aav基因组长度，该表达框或携带其的多核苷酸序列在使用aav病毒载体进行表达时，能保证病毒包装产量，并且经过大量实验摸索发现，当填充序列位于shrna序列3’端时，该表达框或携带其的多核苷酸序列在使用aav病毒载体进行表达时，不仅病毒包装产量能得到保证，还能大大提高目的基因shrna的表达量，提高药物治疗效果。
3、根据本公开的一个方面，本公开提供一种shrna表达框，按照5’-3’的顺序，所述shrna表达框依次含表达shrna的dna序列及填充序列，所述shrna表达框序列长度接近野生型aav基因组长度。所述填充序列可选为人非编码序列。
4、可选地，所述人非编码序列是惰性或无害的，没有功能和活性。在各种特别的方面，人非编码序列不是编码蛋白或多肽的序列，不同于任何以下物质：shrna、aav末端反向重复(itr)序列、启动子、复制点、多腺苷酸序列等。
5、所述人非编码序列为人因子ix的内含子(intron)序列(genbank:k02402.1)、人因子ix的内含子i片段、人粘粒c346的序列或hprt-intron序列1704-14779(genbank:m26434.1)的一段序列或多段序列组合形式；甚至可选为hprt-intron序列1704-14779(genbank:m26434.1)的一段序列。人非编码序列长度可根据不同血清型aav包装容量或其他需求进行调整，不局限于固定长度。
6、可选地，该表达框在使用单链aav病毒载体进行表达或直接使用时，所述序列长度为3.2kb-5.2kb，可选为3.8kb-5.1kb，甚至可选为3.8kb-4.6kb、4.6kb-5.1kb，尤其可选为4.6kb。
7、甚至可选地，该表达框在使用双链aav病毒载体进行表达时，所述shrna表达框序列长度为使用单链aav病毒载体进行表达或直接使用时所述shrna表达框序列长度的一半。可选为3.2kb-5.2kb的一半，可选为3.8kb-5.1kb的一半，甚至可选为3.8kb-4.6kb或4.6kb-5.1kb的一半，尤其可选为4.6kb的一半，即2.3kb。
8、本公开所述的shrna表达框中，表达shrna的dna序列5’端含有启动子，所述启动子可为任意来源启动子，所述启动子包含选自rna聚合酶ii启动子和rna聚合酶iii启动子中的一种或多种。rna聚合酶ii启动子为通常所采用的启动子，例如cag、cmv、sv40、ef1、ub。针对不同发病组织或细胞，可根据具体病理特征选择组织或细胞特异性启动子，如lp1、ck1、dc172、dc190、apoe/haat、apoa-i、tbg、lsp1、hd-ifn等，为了保证目的基因shrna高效表达，启动子可为一个或多个的组合；启动子可为根据实际情况改造的突变体或嵌合体。进一步地，所述启动子选自rna聚合酶iii启动子中的至少一个，所述rna聚合酶iii启动子是u6启动子、h1启动子、7sk启动子，尤其可选的启动子为h1。
9、表达shrna的dna序列为表达任意可用于治疗疾病的shrna的dna序列。可选地，所述表达任意可用于治疗疾病的shrna的dna序列为序列表seq id no:1至序列表seq id no:3中的任一个或多个。例如表达治疗hbv疾病的shrna的dna序列、表达治疗hiv疾病的shrna的dna序列，可选地表达治疗duchenne型肌营养不良症(dmd)的dna序列、用于表达治疗高胆固醇血症的dna序列等。
10、如1)用于表达治疗hbv疾病的任意shrna的dna序列，其中所述shrna的靶序列可由下述dna序列中的19-23nt的片段组成，如:
11、(1)catcctgctgctatgcctcat(seq id no:7)
12、(2)aaggtatgttgcccgtttgtcc(seq id no:8)
13、(3)cctattgattggaaagtatgtcaaa(seq id no:9)
14、(4)tcgccaacttacaaggcctttct(seq id no:10)
15、(5)tgtgctgccaactggatcct(seq id no:11)
16、(6)ccgtgtgcacttcgcttcacct(seq id no:12)
17、(7)ggaggctgtaggcataaattggtctgt(seq id no:13)
18、(8)ggagtgtggattcgcactcct(seq id no:14)
19、2)用于表达治疗hiv疾病的dna序列，所述shrna的靶序列可由下述rna序列中的19-23nt的片段组成，如:
20、(1)aucaaugaggaagcugcagaaugg(seq id no:15)
21、(2)gggaagugacauagcaggaacuacuag(seq id no:16)
22、(3)uaaauaaaauaguaagaauguauagcccu(seq id no:17)
23、(4)uaugggguaccugugugga(seq id no:18)
24、(5)gccaauucccauacauuauugugc(seq id no:19)
25、(6)uuaaauggcagucuagcagaa(seq id no:20)
26、(7)accacacacaaggcuacuucccugau(seq id no:21)
27、(8)acagccgccuagcauuucaucac(seq id no:22)
28、(9)ggauggugcuucaagcuaguaccaguu(seq id no:23)
29、3)用于表达治疗duchenne型肌营养不良症(dmd)的dna序列，其中所述shrna的靶序列可由下述rna序列中的19-23nt的片段组成，如:
30、(1)ugaguaucaucgugugaaag(seq id no:24)
31、(2)uccuuucaucucugggcuc(seq id no:25)
32、(3)aacuuccucuuuaacagaaaagcauac(seq id no:26)
33、(4)aacuuccucuuuaacagaaaagcauac(seq id no:27)
34、(5)caaggaaguuggcauuucaa(seq id no:28)
35、4)用于表达治疗高胆固醇血症的dna序列，其中所述shrna的靶序列可由下述rna序列中的19-23nt的片段组成，如:
36、(1)uuccgaauaaacuccaggc(seq id no:29)
37、(2)aaccgcaguucuuuguagg(seq id no:30)
38、(3)uugguauucagugugauga(seq id no:31)
39、(4)ucaucacacugaauaccaa(seq id no:32)
40、所述表达shrna的dna序列可以是同时表达两个或两个以上shrna的dna序列的组合形式，组合形式可以是2条表达shrna的dna序列的组合，也可以是3条表达shrna的dna序列的组合，但不仅限于2条或3条；2条相邻表达shrna的dna序列可以直接相连或通过接头相连；所述表达的shrna针对治疗靶点可以是单靶点，也可以是多靶点。
41、本公开提供了一种携带shrna表达框的多核苷酸序列，其中在所述shrna表达框的两端分别为aav末端反向重复序列。
42、所述aav末端反向重复序列选自不同血清型的aav，可选地所述aav末端反向重复序列选自进化支a-f中的任意血清型的aav或aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型或其杂交/嵌合型中的任意一个，可选地所述aav末端反向重复序列来源于aav2血清型的末端反向重复序列。其中末端反向重复序列可在相应位点进行改造、或缺失、或截短，以上方法可合并使用。
43、本公开所述的多核苷酸序列中，两个末端反向重复序列间的序列长度为3.2kb-5.2kb，可选为3.8kb-5.1kb，甚至可选为3.8kb-4.6kb、4.6kb-5.1kb，尤其可选为4.6kb；当其中一个末端反向重复序列中的trs被改造，通过插入、缺失、或替代等方式导致rep蛋白切割位点突变不能进行有效切割时，两个末端反向重复序列间的序列长度可选为3.2kb-5.2kb的一半，可选为3.8kb-5.1kb的一半，甚至可选为3.8kb-4.6kb或4.6kb-5.1kb的一半，尤其可选为4.6kb的一半，即2.3kb。
44、可选地，所述多核苷酸序列中5’末端反向重复序列缺失d序列，所述多核苷酸序列两个itr间的序列长度可选为4.6kb-5.1kb的一半，甚至可选为4.6kb的一半。
45、本公开提供了一种携带上述shrna表达框或多核苷酸序列的重组载体质粒。
46、本公开所述的多核苷酸序列可以是商品化合成，可采用分子克隆的方法构建到重组载体质粒中。
47、所述重组载体质粒选自腺相关病毒载体。
48、可选地，所述腺相关病毒载体为各种血清型，如aav进化支a-f中的任一型(参见公开号wo200533321的专利)，具体地为aav1型(genbank:af063497.1)、aav2型(genbank:af043303.1)、aav3型(genbank:u48704.1)、aav4型(genbank:nc_001829)、aav5型(genbank:nc_006152)、aav6型(genbank:af028704)、aav7型(genbank:af513851)、aav8型(genbank:af513852)、aav9型(genbank:ay530579)或其杂交/嵌合型。
49、甚至可选地，所述腺相关病毒载体为aav2/8型，即所述腺相关病毒载体外壳蛋白为血清型viii型、所述腺相关病毒载体基因组末端反向重复序列为血清型ii型的aav2/8载体。所述两端末端反向重复序列间插入与hbv基因组靶点碱基序列完全匹配的本公开的核苷酸序列形成的靶向肝脏细胞分布、表达产物高效特异抑制hbv复制的基因治疗药物。
50、所述腺相关病毒载体最后包装为病毒，在所述多核苷酸序列两侧的itr选自正常aav血清型itr时，包装入病毒的序列为单链，所述病毒称为单链aav；当其中任意一个itr通过插入、缺失、或替代等方式导致rep蛋白切割位点突变不能进行有效切割时，包装入病毒的序列为双链，所述病毒称为双链aav。
51、本公开还提供了一种shrna，其中，所述shrna是由上述的shrna表达框或多核苷酸序列或重组载体质粒表达得到的。
52、本公开还提供了一种宿主，其中，所述宿主含有本公开所述的重组载体质粒。所述宿主为选自大肠杆菌、hek293细胞系、hek293t细胞系、hek293a细胞系、hek293s细胞系、hek293ft细胞系、hek293f细胞系、hek293h细胞系、hela细胞系、sf9细胞系、sf21细胞系、sf900细胞系、bhk细胞系的一种或几种。
53、本公开还提供了一种病毒颗粒，其包括上述的重组载体质粒或宿主中的重组载体质粒的载体基因组。所述病毒颗粒非选择性或选择性地在肝组织或肝癌细胞中表达。
54、本公开还涉及一种分离的改造的细胞，所述细胞表达或包含上述shrna表达框、多核苷酸序列、重组载体质粒、病毒颗粒。该细胞为导入了本公开提供的重组载体质粒或宿主中的重组载体质粒的载体基因组的改造的细胞，包括原核细胞和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细胞)，可选为哺乳动物细胞，可选为人的细胞，可选为人肝细胞和干细胞。
55、本公开还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物。
56、本公开还涉及包含上述细胞的药物组合物。
57、本公开还提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物含有活性成分和药学上可接受的赋形剂，其中活性成分为选自本公开所述的shrna表达框、携带shrna表达框的多核苷酸序列、shrna、重组载体质粒、病毒颗粒或分离的改造的细胞中的一种或几种。
58、所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的赋形剂以及上述的活性成分。
59、本公开还提供了上述shrna表达框、携带shrna表达框的多核苷酸序列或重组载体质粒或shrna、宿主、病毒颗粒或分离的改造的细胞在制备预防和治疗乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征、治疗duchenne型肌营养不良症(dmd)、治疗高胆固醇血症等的药物中的应用。
60、常规aav载体制备系统均可用于本公开重组载体质粒的包装。如两质粒包装系统、三质粒包装系统、杆状病毒包装系统和以ad或hsv为辅助病毒的aav包装系统等。其中所述三质粒包装系统包括质粒pscaav-h1-shrna-stuffer、质粒phelper和质粒paav-r2cx，其中：
61、所述质粒phelper提供腺病毒的e2a、e4和va区域；
62、所述质粒paav-r2cx提供含rep和cap基因序列；
63、所述质粒pscaav-h1-shrna-stuffer含上述多核苷酸序列。
64、其中，x指代构成paav-r2cx重组载体质粒的cap基因来源所对应的aav血清型名称。
65、本公开还提供了一种使用上述制备系统制备本公开所述病毒载体的方法。
66、本公开具有如下有益效果：
67、1、本公开的shrna表达框采用aav病毒为载体进行递送的方式，使shrna能够发挥长效性；相比裸shrna或其他化学修饰的shrna，选择aav作为运载体具有更低的免疫反应原性，安全无致病性；裸shrna在生物体内无明显组织细胞偏好，但是aav不同血清型具有明显的组织靶向性，可大大提高shrna药物疗效。
68、2、本公开提供的shrna表达框，选择合适的填充序列进行使得其长度接近aav野生型基因组长度，使得选择aav病毒载体携带时，保证了包装效率最高；当填充序列位于shrna序列3’端时，该表达框或携带其的多核苷酸序列在使用aav病毒载体进行表达时，不仅病毒包装产量能得到保证，还能大大提高目的基因shrna的表达量，提高药物治疗效果。
69、下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本专利申请公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。
1.一种重组腺相关病毒，其包含：shrna表达框，其中，按照5’-3’的顺序，所述shrna表达框依次含启动子，编码shrna的dna序列，和填充序列；所述填充序列为hprt-intron序列的一段序列，所述填充序列全部位于编码shrna的dna序列的3’端；所述编码shrna的dna序列为编码用于治疗hbv疾病的shrna的dna序列。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒，其中，所述shrna表达框在使用单链aav病毒载体进行携带时，所述shrna表达框序列长度为3.2kb-5.2kb，优选为3.8kb-5.1kb。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺相关病毒，其中，所述shrna表达框在使用双链aav病毒载体进行携带时，所述shrna表达框序列长度为使用单链aav病毒载体进行携带时所述shrna表达框序列长度的一半。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组腺相关病毒，其中，所述shrna表达框中，编码shrna的dna序列5’端含有启动子；优选地，所述启动子包含选自rna聚合酶ii启动子和rna聚合酶iii启动子中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒，其中，所述rna聚合酶ii启动子为组织特异性启动子；优选地，所述rna聚合酶ii启动子为肝脏特异性启动子；更优选地，所述肝脏特异性启动子为lp1、apoe/haat、dc172、dc190、apoa-i、tbg、lsp1或hd-ifn。
6.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒，其中，所述rna聚合酶iii启动子为u6启动子、h1启动子、7sk启动子；优选地，所述rna聚合酶iii启动子为h1启动子，所述h1启动子的序列如genbank:x16612所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的重组腺相关病毒，其中，所述编码shrna的dna序列为序列表seq id no:1至序列表seq id no:3中的任一个或多个；优选地，所述编码shrna的dna序列为如序列表seq id no:2所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述的重组腺相关病毒，其中，所述shrna表达框在使用单链aav病毒载体进行携带时，填充序列hprt-intron的序列如genbank:m26434.1的2161-6160位所示；所述shrna表达框在使用双链aav病毒载体进行携带时，填充序列hprt-intron的序列如genbank:m26434.1的2161-3860位所示。
9.根据权利要求1-8任一项所述的重组腺相关病毒，其中，所述shrna表达框的两端还分别具有aav末端反向重复序列。
10.根据权利要求9所述的重组腺相关病毒，其中，所述aav末端反向重复序列选自不同血清型的aav；优选地，所述aav末端反向重复序列选自进化支a-f中的任意血清型的aav或aav1型、aav2型、aav3型、aav4型、aav5型、aav6型、aav7型、aav8型、aav9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述aav末端反向重复序列来源于aav2血清型的末端反向重复序列。
11.根据权利要求9或10所述的重组腺相关病毒，其中，所述两个末端反向重复序列间的序列长度为3.2kb-5.2kb；当其中一个末端反向重复序列中的trs被改造，通过插入、缺失、或替代等方式导致rep蛋白切割位点突变不能进行有效切割时，两个末端反向重复序列间的序列长度为3.2kb-5.2kb的一半。
12.根据权利要求11所述的重组腺相关病毒，其中，所述5’末端反向重复序列缺失d序列，所述两个末端反向重复序列间的序列长度为4.6kb-5.1kb的一半。
13.根据权利要求1-12任一项所述的重组腺相关病毒，其中，所述腺相关病毒的衣壳蛋白为血清型viii型。
14.一种药物组合物，其包括权利要求1-13任一项所述的重组腺相关病毒和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的赋形剂以及所述活性成分。
16.权利要求1-13任一项所述的重组腺相关病毒或权利要求14或15所述的药物组合物在制备预防和治疗乙型肝炎的药物中的应用。
