本发明属于生物，具体涉及一种新型非核糖体抗真菌肽maafp1及其制备方法和应用。
背景技术：
1、病原真菌或机会致病真菌会感染人体皮肤和深部器官，引起植物病害，污染粮食和饲料，严重影响人类的身体健康和生产生活。艾滋病、器官移植等免疫低下或免疫力缺陷的人群极易感染致病真菌，且死亡率极高。真菌引起的农作物病害可导致农作物产量下降。食品和饲料受到真菌污染后，会导致食品和饲料的腐败变质，部分菌株还会产生真菌毒素，损害人和牲畜的健康。目前可供使用的医用或农用抗真菌药物数量较少、抗菌范围窄，多数抗真菌药物长期使用导致病原菌耐药性增强，使用剂量不断加大，此外许多抗真菌药物具有较强毒副作用。因此，急需安全、高效、广谱的抗真菌新药。
2、昆虫病原真菌能够产生大量具有抗菌、杀虫、抗癌、调节免疫等活性的天然产物作用于昆虫、植物、其它微生物以更好地适应环境变化和占领生境，如白僵菌素和萜类化合物fumosorinone等。全基因组测序及分析发现模式昆虫病原真菌绿僵菌属中多种绿僵菌，如金龟子绿僵菌和罗伯茨绿僵菌，均具有60个以上的次生代谢生物合成簇。然而，目前仅在绿僵菌中发现的数种生物活性物质，表明昆虫病原真菌的天然产物资源丰富值得研究，是开发新型药物分子的重要微生物资源。
3、本发明使用的金龟子绿僵菌cqma421已大规模用作农业害虫防控的微生物杀虫剂，在应用中发现其具有抑制植物叶片上病原真菌生长的作用，进一步从其发酵液中分离纯化出一种非核糖体抗真菌肽maafp1。经测试，该非核糖体肽表现出广谱的抑制真菌萌发和生长的活性。
技术实现思路
1、鉴于此，本发明的目的之一是提供一种新型非核糖体抗真菌肽maafp1，分子式c41h74n18o12，分子量1010.575da，从n端到c端的氨基酸序列为：(d)arg-(l)arg(oh)-(d)orn-(l)thr-(d)orn-(l)arg(oh)-(d)tyr，其中，(l)arg(oh)为l型γ-羟基精氨酸，(d)arg是d型精氨酸，(d)orn是d型鸟氨酸，(l)thr是l型苏氨酸，(d)tyr是d型酪氨酸。maafp1为线性分子(具有游离的氨基和羧基末端)，具有两种非天然氨基酸((l)γ-羟基精氨酸和(d)鸟氨酸)以及天然氨基酸的非天然构型d型((d)精氨酸和(d)酪氨酸)，d型氨基酸和l型氨基酸交替排列。maafp1为白色粉末，暴露于空气中数分钟后，逐渐变成露珠状无色透明液滴；在酸碱性溶液中稳定，α-糜蛋白酶和和蛋白酶k消化后活性无损失；100℃煮沸30分钟后无明显活性损失；易溶于水，溶于甲醇，不溶于如乙酸乙酯、丙酮和二氯甲烷等有机溶剂；maafp1粉末可以常温、密封、干燥、避光保存。
2、优选地，所述抗真菌肽maafp1从金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)cqma421菌株的发酵液中分离纯化获得，所述cqma421菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，菌种保藏编号为cgmcc no.4609。
3、优选地，所述分离纯化的方法包括将所述发酵液经离心、离子交换色谱和高效液相色谱(hplc)，并在280nm的紫外吸收峰进行逐级分离纯化得到。
4、本发明的目的之二是提供一种抑菌剂，所述抑菌剂含有上述抗真菌肽maafp1。
5、本发明的目的之三是提供一种上述抗真菌肽maafp1的制备方法，包括如下步骤：
6、1)发酵液制备：向ph为6.5的1/4sday液体培养基中接种金龟子绿僵菌cqma421孢子悬液使终浓度为5×106个孢子/毫升，在28℃、200rpm培养36h获得发酵液；所述金龟子绿僵菌cqma421保藏编号为：cgmcc no.4609；发酵以链格孢菌(alternaria alternata)为指示菌；注意装液量以20％为宜。
7、2)抗真菌肽粗品制备：离心步骤1)获得的发酵液并收集发酵液的上清；在上清中加入ph5.6的柠檬酸-磷酸钠缓冲液至浓度为20mm后放入沸水浴中孵育30分钟，然后转移至4℃静置过夜后依次使用滤纸和φ＝0.22μm的滤膜进行过滤得到过滤液；使用离子交换色谱分离纯化所述过滤液，分离纯化方法包括：将sp sepharose树脂的层析柱连接至设置检测器波长为280nm，使用20mm、ph5.6的柠檬酸-磷酸钠缓冲液平衡树脂，将过滤液以0.5ml/min的流速进行循环上样，上样结束后使用平衡缓冲液继续洗涤树脂至紫外吸收值保持不变，然后使用含有1m氯化钠的20mm、ph5.6的柠檬酸-磷酸钠缓冲液作为洗脱液，调节参数混合洗脱液和平衡液，使洗脱液占比在60个柱床体积内从0％上升至100％，收集洗脱时间为139.1min的组分；通过冷冻干燥得到抗菌肽粗品；
8、3)抗真菌肽纯品制备：使用高效液相色谱分离纯化步骤2)获得的抗真菌肽粗品，分离纯化方法包括：使用含有0.1％tfa的超纯水和甲醇作为流动相，c18反相色谱柱作为固定相；设定程序为0min甲醇15％、5min甲醇17％、45min甲醇27％、50min甲醇100％；每次进样500μl，流速2ml/min；检测波长为280nm；收集保留时间为29.4min的组分；冷冻干燥得到抗真菌肽maafp1纯品。
9、本发明的目的之四是提供上述抗真菌肽maafp1在制备抗真菌产品中的应用。
10、优选地，所述产品包括药品、化妆品、洗护用品、食品包装、抗菌涂层或农药。
11、优选地，所述抗真菌中的真菌包括曲霉属(aspergillus spp.)、镰刀菌属(fusarium spp.)、总状毛霉(mucor racemosus)、白色念珠菌(candida albicans)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、链格孢属(alternaria spp.)、须毛癣菌(trichophytonmentagrophytes)、核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(botrytis cinerea)、葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)、松针刺盘孢菌(colletotrichumfioriniae)、小孢拟盘多毛孢(pestalotiopsis microspora)和稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)。
12、本发明抗真菌肽maafp1为从金龟子绿僵菌cqma421无细胞上清发酵液中分离并纯化获得的一种抑制多种动植物病原真菌生长的新型非核糖体抗真菌七肽，maafp1分子式为c41h74n18o12，从n端到c端的氨基酸序列为：(d)arg-(l)arg(oh)-(d)orn-(l)thr-(d)orn-(l)arg(oh)-(d)tyr。使用金龟子绿僵菌进行摇瓶发酵，收集发酵液，通过离子交换色谱和高效液相色谱分离纯化获得抗真菌肽maafp1。综合运用edman降解法、质谱、红外光谱、核磁共振波谱和圆二色光谱解析maafp1的结构。通过体外抑菌测试发现，maafp1对多种动物和植物病原真菌具有良好的抑制作用，尤其对aspergillus flavus、aspergillus fumigatus、aspergillus nidulans、aspergillus niger、mucor racemosus、trichophytonmentagrophytes、fusarium verticillioides、candida albicans和cryptococcusneoformans等动物病原真菌的孢子萌发及菌丝生长有较强的抑制效果；对alternariaalternata、alternaria solani、alternaria tenuissima、botrytis cinerea、botryosphaeria dothidea、colletotrichum fioriniae、fusarium fujikuroi、fusariumgraminearum、fusarium oxysporum、pestalotiopsis microspora、magnaporthe oryzae和sclerotinia sclerotiorum等植物病原真菌的孢子萌发及菌丝生长有较强的抑制效果；不抑制pichia pastoris和saccharomyces cerevisiae等酵母以及escherichia coli、erwinia carotovora、pseudomonas syringae和bacillus subtilis等细菌；体外对小鼠和人血细胞无溶血性。本发明抗真菌肽maafp1表现出广谱的抑制真菌生长的活性，优势显著，具有新型抗真菌药物开发的价值，应用前景广阔。
1.一种新型非核糖体抗真菌肽maafp1，其特征在于，分子式为：c41h74n18o12，从n端到c端的氨基酸序列为：(d)arg-(l)arg(oh)-(d)orn-(l)thr-(d)orn-(l)arg(oh)-(d)tyr，所述(l)arg(oh)为l型γ-羟基精氨酸。
2.如权利要求1所述的抗真菌肽maafp1，其特征在于，所述抗真菌肽maafp1从金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)cqma421菌株的发酵液中分离纯化获得，所述cqma421菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为cgmcc no.4609。
3.如权利要求2所述的抗真菌肽maafp1，其特征在于，所述分离纯化的方法包括将所述发酵液经离心、离子交换色谱和高效液相色谱，并在280nm的紫外吸收峰进行逐级分离纯化得到。
4.一种抑菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的抗真菌肽maafp1。
5.一种权利要求1所述的抗真菌肽maafp1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.权利要求1所述的抗真菌肽maafp1在制备抗真菌产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品包括药品、化妆品、洗护用品、食品包装、抗菌涂层或农药。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗真菌中的真菌包括曲霉属(aspergillus spp.)、镰刀菌属(fusarium spp.)、总状毛霉(mucor racemosus)、白色念珠菌(candida albicans)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、链格孢属(alternariaspp.)、须毛癣菌(trichophyton mentagrophytes)、核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(botrytis cinerea)、葡萄座腔菌(botryosphaeria dothidea)、松针刺盘孢菌(colletotrichum fioriniae)、小孢拟盘多毛孢(pestalotiopsis microspora)和稻瘟病菌(magnaporthe oryzae)。
