本发明属于微生物检测，具体涉及甲壳类 amesonspp.微孢子虫的检测引物和探针及其应用。
背景技术：
1、微孢子虫（microsporidia）是一种细胞内专性寄生的真菌类寄生虫，能感染几乎所有的脊椎动物和无脊椎动物。目前已经发现180多个属的微孢子，约1500个种，其中超过80个属可感染水生生物，40多个属可感染甲壳类，约8个属可以感染蟹类，分别是 abelspora、 ameson（ nadelspora）、 areospora、 enterospora、 hepatospora、 nosema、 ormieresia和 thelohania。
2、肌孢虫（ ameson portunus）分类地位为真菌界（fungi），微孢子虫门（microsporidia），微孢子虫纲（microsporea），微孢子虫目（microsporida），皮雷孢子科（pereziidae）， ameson属。 ameson属微孢子虫目前已报道有 a.michaelis、 a.metacarcini、肌孢虫（ a.portunus）、 a.pulvis、 a.iseebi和 a.herrnkindi，以及尚没有确定具体种的 amesonsp.。肌孢虫自2017年首次报道以来，现已成为三疣梭子蟹（ portunus trituberculatus）和拟穴青蟹（ scylla paramamosain）的重要寄生性病原。三疣梭子蟹感染肌胞虫严重时可引起肌肉白化的典型症状，该类症状的病蟹也被称为“牙膏蟹”。肌胞虫检测方法中，陈甜甜等（2017）建立了基于sybr green i染料的定量pcr检测方法，检测灵敏度达到20copies/反应（陈甜甜，房文红，王元，等.梭子蟹肌孢虫sybr green i实时定量pcr检测方法的建立与应用[j].南方水产科学，2017，13（6）：22-29.）；三疣梭子蟹肌孢虫病诊断规程（水产行业标准，sc/t 7239-2020）公布了肌胞虫检测的套式pcr的方法。以上两种方法均是基于该病原的ssu rrna基因设计的引物。
3、2020-2023年我们开展了山东省沿海（主要是日照和潍坊地区）海水蟹类的流行病学调查，新发现多种 amesonsp.，其ssu rrna基因与已公开 amesonsp.的不同确定或未确定种的同源性很高，也发现上述已报道的2种肌胞虫的检测方法并不能对该病原进行特异检测。微孢子没有特效药，这种不特异的检测结果也不利于病防工作的开展。鉴于 amesonsp.种数多且有多个新种发现，以及该属病原（如肌孢虫）对甲壳类的严重寄生危害，建立包括肌孢虫在内的 amesonspp.的有效检测方法对甲壳类健康养殖很有必要。
4、病原的定量检测方法中，dna结合染料（如采用sybr green i等）法较基于探针（如taqman探针等）的化学法存在有特异性不强的缺点。近年来，taqman-mgb探针作为新型探针，较taqman探针在定量检测中可以进一步有效提高检测的特异性和灵敏度。相较于需要昂贵专业设备的检测方法，环介导等温扩增技术（lamp）是一种可以在简易恒温条件下（如水浴锅或金属浴等）即可快速完成检测反应的检测方法，该方法还可通过添加核酸染料到反应产物中通过颜色的变化，进行检测结果的肉眼判断，适合于临床样品的现场诊断。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种甲壳类 amesonspp.微孢子虫的检测引物和探针及其应用，本发明针对 amesonspp.的ssu rrna基因的核苷酸序列设计有：（1）4套荧光定量pcr检测的引物及探针（每套中均包括2条引物和1条探针）；（2）4套等温扩增的引物（每套中包括4-6条引物）。所述引物和探针可用于 amesonspp.的检测，也可用于 amesonsp.新种的发现。
2、本发明通过以下技术方案实现：
3、本发明所述的甲壳类 amesonspp.微孢子虫的检测引物和探针的核苷酸序列如下：
4、（1）4套荧光定量pcr检测引物及探针的核苷酸序列如下：
5、第一套引物和探针的核苷酸序列：
6、1）引物1 ameson-f：5’-atttggtgtcagctaatggtatgg-3’，如seq id no：1所示；
7、2）引物2 ameson-r：5’-ttgtcagtgctttcgcctttg-3’，如seq id no：2所示；
8、3）探针 ameson-probe：5’–tgaagtctgaggatcca-3’，如seq id no：3所示。
9、第二套引物和探针的核苷酸序列：
10、1）引物1 ameson-f：5’-atttgactcaacgcgggaaa-3’，如seq id no：4所示；
11、2）引物2 ameson-r：5’-gccatgcaccaccattttac-3’，如seq id no：5所示；
12、3）探针 ameson-probe：5’-accaagcttatttattcaacg-3’，如seq id no：6所示。
13、第三套引物和探针的核苷酸序列：
14、1）引物1 ameson-f：5’-gttgcggttaaaacgtccgt-3’，如seq id no：7所示；
15、2）引物2 ameson-r：5’-tttccagcttgctactgccc-3’，如seq id no：8所示；
16、3）探针 ameson-probe：5’-ctgacctgtaatctatttgg-3’，如seq id no：9所示。
17、第四套引物和探针的核苷酸序列：
18、1）引物1 ameson-f：5’-actggagggaaagtctggtg-3’，如seq id no：10所示；
19、2）引物2 ameson-r：5’-cgcgactacggacgttttaa-3’，如seq id no：11所示；
20、3）探针 ameson-probe：5’-cagcagccgcggta-3’，如seq id no：12所示。
21、优选的，在荧光定量pcr检测方法中，可同时使用引物和探针或只使用引物。使用探针时， ameson-probe探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；进一步优选，所述的探针可以为taqman-mgb探针，5’端修饰荧光报告基团6-carboxyfluorescein（6-fam），3’端修饰mgb（minor groove binder）-nfq（nonfluorescentquencher）。不使用探针时，除引物 ameson-f/ ameson-r外，可另添加荧光核酸染料。
22、引物和探针在检测体系中的终浓度均为0.1-0.5μm，优选，检测体系中的 ameson-f/ ameson-r和 ameson-probe的终浓度分别为0.2μm和0.3μm。
23、荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，反应温度58-63℃ 30s，共40个循环，优选，反应温度为60℃。
24、检测结果判断：使用探针的荧光定量pcr检测中，在阴性对照无污染的情况下，样品有扩增曲线时，视为样品 amesonspp.检测阳性；不使用探针的荧光定量pcr检测中，样品的溶解曲线为单峰，视为样品 amesonspp.检测阳性。定量分析中，依据模板与ct值间的线性关系和检测样品的ct值可对样品中病原载量进行计算。
25、第一套基于taqman-mgb探针的荧光定量pcr检测引物 ameson-f、 ameson-r和探针 ameson-probe在样品中检测中，以质粒标准品为模板，其核酸拷贝数的对数值（x）与ct值（y）线性表达式为y=-3.119x+38.978。
26、（2）4套等温扩增检测引物的核苷酸序列如下：
27、第一套引物的核苷酸序列：
28、1）引物1 ameson-f3：5’-cggtaataccagctccagga-3’，如seq id no：13所示；
29、2）引物2 ameson-b3：5’-gcctctgtccttgatcaaca-3’，如seq id no：14所示；
30、3）引物3 ameson-fip：
31、5’-tccagcttgctactgcccctatttttttaaaacgtccgtagtcgcg-3’，如seq id no：15所示；
32、4）引物4 ameson-bip：
33、5’-agctaatggtatggggaggggtttttgctttcgcctttgctcctc-3’，如seq id no：16所示；
34、5）引物5 ameson-lf：5’-aaatagattacaggtcagtcccaag-3’，如seq id no：17所示。
35、第二套引物的核苷酸序列：
36、1）引物1 ameson-f3：5’-gcttgggactgacctgta-3’，如seq id no：18所示；
37、2）引物2 ameson-b3：5’-cgtattcgatcctctagcct-3’，如seq id no：19所示；
38、3）引物3 ameson-fip：
39、5’-cataccattagctgacaccaaattgttttgtcaacagatagataggggc-3’，如seq id no：20所示；
40、4）引物4 ameson-bip：
41、5’-gaggggtgaagtctgaggatttttttgatcaacagaatcaatctttgtc-3’，如seq id no：21所示；
42、5）引物5 ameson-lf：5’-tcttttccagcttgctact-3’，如seq id no：22所示；
43、6）引物6 ameson-lb：5’-ccatgcaggaggagca-3’，如seq id no：23所示。
44、第三套引物的核苷酸序列：
45、1）引物1 ameson-f3：5’-gatcgaatacgattagataccg-3’，如seq id no：24所示；
46、2）引物2 ameson-b3：5’-ttggtaagttttcccgcg-3’，如seq id no：25所示；
47、3）引物3 ameson-fip：
48、5’-tccccccggagatctattttgattttttagtagttctagcagtgaccg-3’，如seq id no：26所示；
49、4）引物4 ameson-bip：
50、5’-gtacatgcgcaagcaagaaacttttttgagtcaaattaagccgaac-3’，如seq id no：27所示；
51、5）引物5 ameson-lb：5’-aaagaaattgacggaagactaccac-3’，如seq id no：28所示。
52、第四套引物的核苷酸序列：
53、1）引物1 ameson-f3：5’-gtaaaatggtggtgcatgg-3’，如seq id no：29所示；
54、2）引物2 ameson-b3：5’-tgttcatgagtgcttttcag-3’，如seq id no：30所示；
55、3）引物3 ameson-fip：
56、5’-tctttcgaacaagctattctgagatttttcagatggagtgattttgtgat-3’，如seq id no：31所示；
57、4）引物4 ameson-bip：
58、5’-tgcacgcgcaatacaatgttttttccctcaatccctcatgtt-3’，如seq id no：32所示。
59、优选的，等温扩增检测的反应体系以25μl计，包括以下组分：10×isothermalamplification buffer 2.5μl，终浓度为4.0-12.0mm的mgso4，终浓度为0.1-1.4mm的甜菜碱（betaine），终浓度为0.8-1.8mm的dntps，20μm ameson-fip/ ameson-bip 2μl，10μm ameson-f3/ ameson-b3 0.5μl，20μm ameson-lf/ ameson-lb 1μl，终浓度为0.128-0.576u/ul的 bst2.0 warmstart®dna聚合酶（8000u/ml，newenglandbiolabs）， amesonspp.的dna模板1μl，并补充水至25μl，另外，还可在体系中添加0.5-2.5μm的20×evagreen®dye（biotium）1μl。反应温度为60.0℃-68.0℃，置于实时荧光定量pcr仪，反应60min（60个循环，每个循环1min）。
60、使用所述等温扩增检测引物进行检测时，检测方法为等温扩增或荧光定量pcr，可以使用各套等温扩增引物中的如下引物：
61、 ameson-f3、 ameson-b3、 ameson-fip和 ameson-bip；
62、也可以使用 ameson-f3、 ameson-b3、 ameson-fip、 ameson-bip和 ameson-lf；
63、也可以使用 ameson-f3、 ameson-b3、 ameson-fip、 ameson-bip和 ameson-lb；
64、还可以使用 ameson-f3、 ameson-b3、 ameson-fip、 ameson-bip、 ameson-lf和 ameson-lb。
65、上述的lamp检测中，添加evagreen®dye的体系置于定量pcr仪器中，可依据扩增中较少ct值及试剂成本考虑，进行检测反应体系和温度的优化，该检测中，可通过模板量与ct值间的线性关系，对检测样品中 amesonsp.载量进行定量分析；不添加evagreen®dye时，可依据产物的阶梯状电泳条带的亮带和试剂成本考虑，进行反应条件的优化。该检测中，可通过扩增产物中加入2%体积核酸染料（如genefindertm），通过产物管中颜色的变化进行简易等温条件的样品的现场诊断。
66、本发明的引物和探针可用于非疾病的诊断和治疗目的的 amesonspp.的检测及定量分析，也可用于检测试剂或试剂盒产品的开发，也可用于新 amesonsp.的发现。
67、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
68、1、本发明基于大量流行病学研究后有如下新发现：
69、1）发现多种 amesonsp.，发现并确定 amesonspp.的ssu rrna基因保守区域，设计并提供可有效进行包括肌孢虫在内的 amesonspp.检测的引物和探针。2）本发明可应用于 amesonsp.的新种发现。
70、2、灵敏度高、特异性强：
71、本发明taqman-mgb探针的荧光定量pcr的4.58拷贝/反应的检测灵敏度要优于已报道的基于sybr green i染料的定量pcr检测方法，该探针的应用后的检测特异性要优于基于sybr green i染料法的定量pcr检测。
72、3、方便快捷，可用于现场检测：
73、本发明提供的等温扩增的检测引物及检测方法，可以简易恒温条件下（如水浴锅或金属浴等）中完成检测，产物中添加核酸荧光染料sybr green或genefindertm或金属离子指示染料钙黄绿素等，可以进行现场检测结果的判断。
1.一种甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针，其特征在于：所述的引物和探针的核苷酸序列如下：
2.一种权利要求1所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：用于非疾病的诊断和治疗目的的ameson spp.微孢子虫的检测和新ameson sp.的发现。
3.如权利要求2所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用所述荧光定量pcr检测引物及探针进行检测时，同时使用引物和探针或只使用引物。
4.如权利要求3所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：所述探针的5’端修饰荧光报告基团6-fam，3’端修饰荧光淬灭基团mgb-nfq。
5.如权利要求3所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：引物和探针在检测体系中的终浓度均为0.1-0.5μm。
6.如权利要求3所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用荧光定量pcr检测的第一套引物和探针进行检测时，质粒标准品核酸拷贝数的对数值x与ct值y线性表达式为y=-3.119x+38.978。
7.如权利要求2所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：使用所述等温扩增检测引物进行检测时，检测方法为等温扩增或荧光定量pcr，使用引物为ameson-f3、ameson-b3、ameson-fip和ameson-bip，或ameson-f3、ameson-b3、ameson-fip、ameson-bip和ameson-lf，或ameson-f3、ameson-b3、ameson-fip、ameson-bip和ameson-lb，或ameson-f3、ameson-b3、ameson-fip、ameson-bip、ameson-lf和ameson-lb。
8.如权利要求7所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：反应温度为60.0-68.0℃，反应体系中mgso4的浓度为4.0-12.0mm，甜菜碱的浓度为0.1-1.4mm，dntps的浓度为0.8-1.8mm，bst 2.0 warmstart®dna聚合酶的浓度为0.128-0.576u/μl。
9.如权利要求8所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：反应体系还包括终浓度为0.5-2.5μm的evagreen® dye。
10.如权利要求2所述的甲壳类ameson spp.微孢子虫的检测引物和探针的应用，其特征在于：包括用于制备检测试剂或试剂盒产品。
