本发明属于医学成像或诊断领域，涉及靶向结合弹性蛋白的新型探针，其为糖肽类和脂糖肽类分子的偶联物。
背景技术：
1、弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，也是构成细胞外基质的主要成分之一，主要存在于结缔组织、血管组织、肺和皮肤中。它们提供了脊椎动物组织所需要的重复性拉伸和弹性反冲特性。弹性蛋白的肽链含有713个以上的氨基酸残基。弹性蛋白的氨基酸序列中不存在贯穿整个肽链的连续的重复性结构，但是存在交替的疏水和亲水性片段。在正常情况下，弹性蛋白分布没有胶原蛋白广泛，但也是许多组织必不可缺的基质成分。而在器官纤维化、肿瘤等众多疾病中，弹性蛋白合成的平衡状态会被打破，造成过度增生而大量增多，造成器官和肿瘤内部的纤维化，影响器官的正常生理功能和化疗药物向肿瘤内部的递送与渗透。因此，弹性蛋白是众多重要疾病的关键生物标志物，建立弹性蛋白的高效、特异的检测方法，对这些疾病的病理机制的探索与准确诊断至关重要。
2、目前现有技术报道的弹性蛋白探针较少，例如结构如下的esma探针(sunq,etal.,elastin imaging enables noninvasive staging and treatment monitoring ofkidneyfibrosis,science translational medicine,2019,11,486,eaat4865.doi:10.1126/scitranslmed.aat4865.pmid:30944168；pmcid:pmc7115882)：
3、
4、目前弹性蛋白的检测方法主要是组织染色法，包括h&e染色法、weigert’s vangeison法、verhoeff-van gieson法、gomori trichrome染色法等。其他的方法包括弹性蛋白抗体免疫成像、自发荧光成像、以及使用可结合弹性蛋白的荧光染料成像(例如sulforhodamine b和alexa fluor633hydrazide)等。这些方法具有操作复杂、探针结合能力弱、特异性不强、分辨率不高，信噪比不高，只能在体外组织上检测等缺点。因此，亟需建立一种能在体外组织水平与活体动物水平同时具有强结合力、高特异性、高信噪比和高生物相容性的检测方法，该方法的发展将会对癌症、器官纤维化及心血管疾病等与弹性蛋白密切相关的重要疾病的诊断与成像具有重要意义。
技术实现思路
1、针对已有的需求和问题，本发明的目的在于提供了基于糖肽类和脂糖肽类分子的靶向弹性蛋白的新型探针及其生物医学应用。所用材料简单易得，制备方法简单，特异性强，对弹性蛋白具有良好的结合能力，信噪比高，生物相容性好，实验操作流程方便简单。该探针的发现，为在分子水平观察弹性蛋白的变化提供了方法，在癌症、器官纤维化及心血管疾病等与弹性蛋白密切相关的重要疾病的诊断与成像等领域具有巨大的应用前景。
2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
3、本发明第一方面提供基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针在制备药物中的应用，其中所述药物用于组织切片的成像或诊断，所述基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针包括糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素部分和荧光成像部分。
4、在本发明优选的方面，其中基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针具有如下式(i)所示结构的化合物或其药用盐：
5、t-(b1-l-b2-r)n(i)
6、其中t为靶向弹性蛋白的靶向基团，r为功能基团；
7、b1为l与靶向基团t的连接体或直连键；
8、l为连接臂或不存在；
9、b2为功能基团r与l的连接体或直连键；
10、b2为直连键，是指l为功能基团r的一部分或不存在；
11、b1为直连键，是指l为靶向基团t的一部分或不存在；
12、当l不存在时，r通过b1或b2与t连接；
13、t为糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子；
14、r为荧光成像部分；
15、n为1-10的整数。
16、在某些实施例中，b1为共价连接键，优选酰胺键或酯键。
17、在某些实施例中，其中b2为共价或非共价的方式形成的连接体，优选的，共价连接方式包括：点击化学反应、交联反应、缩合反应；优选的，非共价连接的方式包括：静电作用、疏水相互作用、亲和作用、抗体-抗原结合、生物素-亲合素结合。
18、在某些实施例中，l具有约1-约100个连接原子，且任选包括乙烯氧基((ch2ch2o))部分，胺，酯，酰胺，酮，脲，氨基甲酸酯和碳酸酯官能团；
19、优选的，l为2-20个碳原子的直链或支链烷基；
20、优选的，l为2-10个乙烯氧基((ch2ch2o))单元的聚乙二醇基。
21、在某些实施例中，所述荧光成像部分是通过一辐射波长激发并在第二、不同的辐射波长检测进行检测的荧光化合物或纳米聚集体，包括可见光或近红外荧光探针，优选的光学探针包括荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子优选花氰染料(cy染料)或吲哚菁绿染料(icg染料)、bodipy类分子、方酸类分子、方酸菁分子、磷光分子、半导体分子、碳量子点、硅量子点、硫量子点、硒量子点、碲量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料和螯合剂中的一种或几种，优选如cy5.5、cy3、cy5、alexa(亚历克萨)680、did(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐)和dir(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)。
22、在某些实施例中，糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子优选为:
23、万古霉素抗生素，结构为：替考拉宁抗生素，结构为：其中r’为
24、特拉万星抗生素，结构为：达巴万星抗生素，结构为：奥利万星抗生素，结构为：伊端霉素抗生素，结构为：其中r”为h或者cl；
25、巴尔赫霉素抗生素，结构为：瑞斯托霉素抗生素，结构为：雷莫拉宁抗生素，结构为：其中r”’为上述定义中的t为基团的连接位点。
26、在某些实施例中，所述探针优选：
27、基于万古霉素抗生素的探针，结构为：基于替考拉宁抗生素的探针，结构为：其中r’为
28、基于特拉万星抗生素的探针，结构为：基于达巴万星抗生素的探针，结构为：基于奥利万星抗生素的探针，结构为：基于伊端霉素抗生素的探针，结构为：其中r”为h或者cl；
29、基于巴尔赫霉素抗生素的探针，结构为：基于瑞斯托霉素的探针，结构为：
30、基于雷莫拉宁的探针。结构为：
31、其中r”’为
32、其中，如上各式中的t为基团连接位点，r1至r27各自独立地表示光学染料的修饰或h，条件是上述各式中至少含有一个光学染料修饰。
33、在某些实施例中，所述探针可以以药学上可接受的盐的形式存在，为酸加成盐包括乙酸盐、已二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、已酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯基磺酸盐、甲烷磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯醋酸盐、三氟醋酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对-甲苯磺酸盐及十一烷酸盐；或为碱性加成盐，所述碱性加成盐的阳离子包括锂、纳、钾、钙、镁及铝，以及无毒的季铵阳离子例如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗琳、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、n,n二苄基苯乙胺以及n,n'-二苄基乙二胺。
34、进一步的，所述组织切片包括但不仅限于动物组织切片和人类病理组织切片；优选的，组织切片包括但不仅限于良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织或辐射损伤组织；优选的，所述组织切片为冰冻切片或石蜡切片。
35、本发明第二方面提供一种组织切片成像试剂盒，其中包含基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针，以及选自组织清洗剂、组织透明化试剂、组织固定化试剂、封闭剂或抗荧光淬灭封片剂中至少一种的试剂。
36、进一步的，本发明所述的组织切片成像试剂盒，其中基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针为本发明第一方面定义的化合物或其药用盐。
37、本发明体外组织切片成像的具体方法包括：
38、所述体外组织切片成像中的组织切片为冰冻切片或石蜡切片，含有所述靶向探针的溶液中所述靶向探针的浓度为0.1μmol/l-2mol/l；对除去包埋试剂的组织切片，滴加500μl封闭液，封闭30min后吸走液体；首先使用200-500μl探针溶液在常温下染色15-30min后洗去；然后使用200-500μl细胞核染色剂对细胞核进行染色10min；洗去细胞核染色剂后，滴加封闭液，盖上盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；所述细胞核染色剂为dapi或hoechst33342。
39、优选地，所述组织切片包括但不仅限于动物组织切片和人类病理组织切片。其中组织切片包括但不仅限于良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科组织疾病、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织或辐射损伤组织等。
40、技术术语
41、弹性蛋白
42、弹性蛋白是弹性纤维(elastic fibers)的主要成分。弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁。弹性纤维与胶原纤维共同存在,赋予组织以弹性和抗张能力。象胶原一样，弹性蛋白也富含甘氨酸和脯氨酸，但是与胶原不同的是，弹性蛋白的羟基化程度不高，没有羟赖氨酸的存在。弹性蛋白分子间通过赖氨酸残基形成共价键进行相互交联，它们形成的交联网络可通过构型的变化产生弹性。
43、众多疾病中，例如：良性肿瘤、恶性肿瘤、骨科组织疾病、器官纤维化如肺纤维化、炎症、组织增生、动脉粥样硬化、肝硬化、皮肤光损伤、皮肤热损伤、皮肤酸碱腐蚀或辐射损伤，弹性蛋白合成的平衡状态会被打破，造成过度增生而大量增多，造成器官和肿瘤内部的纤维化，影响器官的正常生理功能和化疗药物向肿瘤内部的递送与渗透。因此，弹性蛋白是众多重要疾病的关键生物标志物。
44、基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针/靶向弹性蛋白的探针
45、基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针为现有技术已知，例如cn108982430b报道了相应探针用于微生物标记，其为光学染料标记的糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子。
46、本发明优选基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针中的一种或多种，所述基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针包括基于万古霉素的荧光探针、基于替考拉宁的荧光探针、基于特拉万星的荧光探针、基于达巴万星的荧光探针、基于奥利万星的荧光探针、基于伊端霉素的荧光探针、基于巴尔赫霉素的荧光探针以及基于瑞斯托霉素的荧光探针。
47、本发明发现了基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针靶向弹性蛋白的特性，在本发明中基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子的荧光探针与靶向弹性蛋白的探针具有相同的含义。
48、糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素
49、糖肽类(glycopeptide)抗生素在结构上共同具有高度修饰的七肽骨架，作用靶点在细菌胞壁成分d-丙氨酰-d-丙氨酸上。依据所含氨基酸的不同可分为四个族：vancomycin族，ristocetin族，avoparcin族，synmonicin族。
50、脂糖肽类(lipoglycopeptide)抗生素是指在糖肽类抗生素糖环或氨基酸侧链上连接疏水基团形成的分子。
51、优选的糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素包括替考拉宁、万古霉素、特拉万星、达巴万星、奥利万星、伊端霉素、巴尔赫霉素以及瑞斯托霉素等。
52、连接臂(linker)或空间臂(spacer)
53、在本发明中连接臂(linker)或空间臂(spacer)具有相同的含义。
54、代表性的连接臂可以具有约1-约100个连接原子，且可包括乙烯氧基部分，胺，酯，酰胺，酮，脲，氨基甲酸酯和碳酸酯官能团。用于本发明方法的其他连接体可以具有约1-约50个连接原子，或约1-约10个连接原子，或约5-约10个连接原子。
55、优选的，l为2-20个碳原子的直链或支链烷基；
56、优选的，l为2-10个乙烯氧基((ch2ch2o))单元的聚乙二醇基。
57、在本发明的某些实施例中，连接臂(linker)或空间臂(spacer)是功能基团的一部分，例如使用使用cy5-nhs形成的探针，cy5分子中烷基起到连接臂作用。
58、
59、连接体
60、本发明中，连接体是指linker与靶向基团之间，linker与功能基团之间，或者在linker不存在的情况下，靶向基团与功能基团之间形成的共价或非共价连接结构。
61、优选的，linker与靶向基团之间形成的连接体b1为共价连接键，优选酰胺键或酯键。
62、优选的，linker与功能基团之间形成的b2为共价或非共价方式的连接，优选的，共价连接方式包括点击化学反应、交联反应、缩合反应；优选的，非共价连接的方式包括静电作用、疏水相互作用、亲和作用、抗体-抗原结合、生物素-亲合素结合。
63、在本发明某些实施例中，本发明所述的连接体为直连键，所述直连键为有机化合物两个非氢原子之间(例如c-c之间、c-n之间或c-o之间)形成的共价键，在这些实施例中用作间隔臂的基团通过直连键与功能分子或靶向基团的主体结构连接。
64、药学上可接受的盐
65、所述探针可以以药学上可接受的盐的形式存在，当在此使用时，术语"药学上可接受的盐"表示所述探针的盐或两性离子形式，其可溶于水或油或者是可分散的，其在合理医学判断范围内，适用于与患者的组织相接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相匹配，并且对于它们所预期的用途是有效的。可以在所述化合物和/或诊断剂的最终分离及纯化期间制备所述盐，或者通过将适宜的氮原子与适宜的酸反应来分离所述盐。典型的酸加成盐包括乙酸盐、已二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、已酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯基磺酸盐、甲烷磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯醋酸盐、三氟醋酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对-甲苯磺酸盐及十一烷酸盐。可以用来形成药学上可接受的加成盐的酸的例子包括无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸及磷酸，以及有机酸例如草酸、马来酸、琥珀酸及柠檬酸。
66、可以在所述探针的最终分离及纯化期间通过使羧基基团与适宜的碱，例如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或者与氨或有机伯、仲或叔胺反应来制备碱性加成盐。所述药学上可接受的盐的阳离子包括锂、纳、钾、钙、镁及铝，以及无毒的季铵阳离子例如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗琳、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、n,n二苄基苯乙胺以及n,n'-二苄基乙二胺。其它可用于形成碱加成盐的典型有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、葡甲胺、哌啶以及哌嗪。
67、光学染料
68、所述光学染料是通过一辐射波长激发并在第二、不同的辐射波长检测进行检测的荧光化合物或纳米聚集体，优选的光学探针包括荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子优选花氰染料(cy染料)或吲哚菁绿染料(icg染料)、bodipy类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体分子、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料和螯合剂中的一种或几种，优选如cy5.5、cy3、cy5、alexa(亚历克萨)680、did(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐)和dir(1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物)。
69、组织切片
70、组织切片指以生物组织为材料，处理为薄片，应用于玻片以适合显微镜观察，是组织学发展的重要工具及方法，常伴随着显微镜技术的发与玻片的制作技术改进而发展，组织切片广泛应用在生物学、医学(病理学、传染病学等)等领域。
71、优选的，本发明所述的组织切片为含有弹性蛋白的组织切片。
72、优选的，本发明所述的组织切片为病理切片，进一步优选的，为疾病导致弹性蛋白异常的切片。
73、本发明提供的靶向弹性蛋白的新型探针及其生物医学应用，所选用的原料分子结构明确，采用共价或非共价连接技术，制备方法简单，生物相容性高，无明显毒副作用。该探针对弹性蛋白具有较高的特异性，对弹性蛋白具有良好的结合能力，信噪比高，具有较高的时空分辨率，可以有效地应用于一些弹性蛋白病变疾病的诊断与成像，为与弹性蛋白相关的疾病的诊断提供了新的方法。
1.基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针在制备药物中的应用，其中所述药物用于组织切片的成像或诊断，所述基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针包括糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素部分和荧光成像部分。
2.如权利要求1所述的应用，
3.如权利要求2所述的应用，
4.如权利要求2所述所述的应用，
5.如权利要求4所述所述的应用，
6.如权利要求1-2任一所述的应用，其中所述荧光成像部分是通过一辐射波长激发并在第二、不同的辐射波长检测进行检测的荧光化合物或纳米聚集体，包括可见光或近红外荧光探针。
7.如权利要求6所述的应用，其中所述荧光成像部分包括荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、花氰染料(cy染料)、吲哚菁绿染料(icg染料)、bodipy类分子、方酸类分子、方酸菁分子、磷光分子、半导体分子、碳量子点、硅量子点、硫量子点、硒量子点、碲量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料和螯合剂中的一种或几种。
8.如权利要求1-2任一所述的应用，其中糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素分子为:
9.如权利要求1-2任一所述的应用，
10.如权利要求1-2任一所述的应用，所述探针可以以药学上可接受的盐的形式存在，为酸加成盐包括乙酸盐、已二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、已酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯基磺酸盐、甲烷磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯醋酸盐、三氟醋酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对-甲苯磺酸盐及十一烷酸盐；或为碱性加成盐，所述碱性加成盐的阳离子包括锂、纳、钾、钙、镁及铝，以及无毒的季铵阳离子例如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、n,n-二甲苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗琳、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、n,n二苄基苯乙胺以及n,n'-二苄基乙二胺。
11.如权利要求1-2任一所述的应用，所述组织切片包括动物组织切片和人类病理组织切片，所述成像和诊断通过所述探针对弹性蛋白的染色进行。
12.如权利要求1-2任一所述的应用，所述组织切片包括良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、骨科疾病组织、纤维化组织、炎症组织、增生组织、动脉粥样硬化组织、肝硬化组织、皮肤光损伤组织、皮肤热损伤组织、皮肤酸碱腐蚀组织或辐射损伤组织。
13.如权利要求1-2任一所述的应用，所述组织切片为冰冻切片或石蜡切片。
14.一种组织切片成像试剂盒，其中包含基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针，以及选自组织清洗剂、组织透明化试剂、组织固定化试剂、封闭剂或抗荧光淬灭封片剂中至少一种的试剂。
15.如权利要求14所述的组织切片成像试剂盒，其中基于糖肽类抗生素或脂糖肽类抗生素的荧光探针为权利要求2-10任一所定义的探针或其药用盐。
