本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可用于共价偶联到核酸干扰(rnai)药物分子中的5’-端修饰的新型核苷酸及其应用。
背景技术：
1、rna干扰(rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-strandedrna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象(有时也通过反义寡核苷酸干扰实现)，可以使相应基因表达量下调，导致相应基因在转录后的沉默。
2、从基因水平上，通过rnai几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而rnai已成为最热门的生物医药研究领域，也是未来最有发展前景的新药开发方向。目前已有9款反义寡聚核酸(aso)药物和5款sirna药物作为rnai药物进入了临床应用。在抗感染、代谢和遗传性疾病治疗方面发挥着独特的作用。
3、sirna响应机制是一种以核酸内切酶复合物为特征介导的rna干扰方式。该核酸内切酶复合物通常称为rna诱导沉默复合物(risc)。risc通过结合sirna反义链，招募靶基因mrna并进行互补性配对，对靶基因mrna进行降解。
4、sirna优点在于可以靶向致病基因组中的任何基因，有强力和持久的药理作用和疗效，还可以显著降低给药频率，提高患者用药的依从性，从而达到更好的治疗效果和更优的安全性。
5、然而，sirna疗法在开发中也遇到了独特的挑战。除了如何将sirna药物分子靶向递送到其作用的细胞中外，还要使被递送的sirna药物分子安全、快速、持久地发挥药效，即提高sirna分子的成药性，一直是药物研发人员的核心关注点。
6、业已证明，小核酸药物依靠独特的化学修饰可以降低体内的免疫原性和脱靶效应；不同修饰位点对沉默效率、代谢稳定性影响也不尽相同。某些已知的修饰核苷酸单体在被引入到sirna小核酸序列中时，会提高rnai疗效的安全窗口和/或活性。
7、另一方面，尽管目前的galnac平台能够高效地将sirna递送到肝实质细胞中，但仅有很少的一部分sirna分子从内涵体逃逸，接着被装载到细胞质中risc复合物中才能发挥其药理作用。大量sirna分子其实被限制在内涵体内，因此，通过对核苷单体的化学修饰来增强小核酸分子的代谢稳定性，或提升逃逸后sirna分子的risc装载效率(loadingefficiency)将无疑会进一步提高小核酸药物分子的疗效及成药性能。
8、因此，本领域里对小核酸进行新颖修饰，特别是对于核苷单体新型的化学修饰有着十分重要的价值。
技术实现思路
1、为了进一步提升sirna的成药性能，本发明通过新型核酸化学手段，对非常规核苷酸单体进行修饰，并引入到sirna序列之中，进一步优化sirna的成药性，提升sirna药物分子的治疗疗效。
2、除非有特别说明，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
3、术语：
4、如本发明所用，术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实施例则包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧基、羧基或羧酸酯基。
5、如本发明所用，术语“烯基”指由至少由两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的、且取代位点必须在碳碳双键的其中一个碳原子上的如上所述烷基。例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
6、如本发明所用，“小核酸”是含有约10-50个单链核苷酸或双链核苷酸碱基对的寡聚核苷酸序列。在一些实施方式中，小核酸具有与细胞内表达的靶基因核心序列至少部分互补的核碱基序列。在一些实施方式中，寡核苷酸在递送至表达靶基因的细胞后，能调控相应靶基因的表达。靶基因表达可以在体外或体内被调控。“小核酸”包括但不限于：寡核苷酸、单链寡核苷酸、单链反义寡核苷酸、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、核酶、干扰性rna分子和dicer酶底物。
7、如本发明所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，其中每一个核苷可独立地被修饰或不被修饰。
8、如本发明所用，“rnai药物”是指含有能够以序列特异性方式降低或抑制信使rna(mrna)翻译的rna或rna类(例如化学修饰的rna)寡核苷酸分子。
9、如本发明所用，rnai药物可以通过rna干扰机制(例如通过与哺乳动物细胞的mrna干扰通路机制(rna诱导沉默复合物risc)的相互作用来诱导mrna降解)、或其它任意机制或通路发挥作用。虽然认为本发明所用的术语rnai药物主要通过rna干扰机制发挥作用，但所述rnai药物并不受限于或局限于任何特定的作用通路或机制。rnai药物包括但不限于：单链寡核苷酸、单链反义寡核苷酸、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)和dicer酶底物。本发明所述的rnai药物由具有与作为靶标的mrna至少部分互补的寡核苷酸链构成。在一些实施方式中，本发明所述的rnai药物是双链的，且由反义链和与该反义链至少部分互补的正义链构成。
10、如本发明所用，术语“沉默”、“减少”、“抑制”、“下调”、或“敲减”指给定的基因表达时，用本发明所述的rnai药物分子处理细胞、组织、器官或动物体内直接给药时，与未经如此处理的细胞、组织、器官或动物体内给药相比，基因的表达水平有所减少或下调。
11、如本发明所用，术语“序列”或“核苷酸序列”是指核苷酸碱基序列、或核苷酸的顺序、或次序，使用标准核苷酸命名法以字母顺序表示。
12、如本发明所用，“核苷酸碱基”或“核碱基”是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其中常规核酸的标准组分，包括腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)常规核苷酸的碱基。核碱基可以被修饰或被新型非常规核碱基替代。
13、如本发明所用，术语“杂环碱基部分”是本发明所定义的、可替代核碱基的、新型含氮杂环碱基或修饰核碱基。在一些实施方式中，杂环碱基部分是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤以及含氮杂环。在一些实施方式中，杂环碱基部分是非常规的嘌呤或取代的嘌呤。在一些实施方式中，杂环碱基部分是非常规的嘧啶或取代的嘧啶。在一些实施方式中，杂环碱基部分含有非天然五元含氮杂环。在一些实施方式中，尤其是当本发明所述的5’-修饰核苷酸是亚磷酰胺化合物时，杂环碱基部分可以包含一个或多个保护基团。
14、如本发明所用，“核糖基替代基”是指能够替代天然存在的核糖核苷酸的五元呋喃糖环的结构，例如吗啉基、环己烯基、环己六醇、或开环的结构等。
15、如本发明所用，术语“互补”在用于描述第一核苷酸序列(例如rnai药物正义链或靶标mrna)和第二核苷酸序列(例如单链反义寡核苷酸或双链rnai药物反义链)之间的关系，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸在某些条件下(在哺乳动物生理条件下或类似的体外条件下)形成碱基配对并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包含沃森-克里克碱基配对或非沃森-克里克碱基配对，且包含天然或修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其程度至少能满足上述配对的要求。例如，就确定相同性或互补性的目的而言，单体a和af与u(或t)互补，并且等同于a。
16、当本发明所述的化合物(例如在烯烃或亚胺)含有双键时，旨在表示该化合物可同时包含z和e几何异构体(又称顺式和反式异构体)。同样地，也旨在包括所有互变异构形式。本发明中出现的任何键的构型图示只是出于方便而选择的，不旨在限制特定的构型，除非文中另有说明。
17、如本发明所用，“保护基团”是指本领域已知的用于防止反应性基团(例如羟基、氨基、羧基和巯基)在合成过程中发生不希望反应的不稳定的化学部分。保护基团通常选择性和/或正交地用于在反应中的其它反应性位点保护位点，并且随后被除去而释放出未保护的基团，使其能够用于进一步反应。在一些实施方式中，“取代的”基团或取代基包含保护基团。
18、本发明所述的化合物和组合物可以具有处于质子化或脱质子化状态的某些原子(例如n、o或s原子)，这取决于该化合物或组合物所处的环境。因此，如本发明所用，本发明所述的结构考虑到某些官能团、例如oh、sh或nh可以质子化或脱质子化。本发明的公开内容旨在涵盖上述的化合物和组合物，而无论它们基于环境ph的质子化状态如何，这是本领域普通技术人员容易理解的。
19、如本发明所用，术语“正义链”是指rna分子上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链、有义链、或正链，而与其互补的另外一条核苷酸序列即为反义链。
20、如本发明所用，术语“烷氧基”指-o-(烷基)或者-o-(环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
21、如本发明所用，术语“卤代烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
22、术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。
23、芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
24、术语“羟基”指-oh基团
25、术语“卤素”指氟、氯、溴或碘
26、术语“氨基”指-nh2
27、术语“氰基”指-cn
28、术语“硝基”指-no2
29、术语“羰基”指＝o
30、术语“羧基”指-c(o)oh
31、术语“巯基”指-sh
32、术语“酯基”指-c(o)o(烷基)或-c(o)o(环烷基)，其中烷基和环烷基如上所定义。
33、术语“酰基”指含有-c(o)r基团的化合物，其中r为烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基。
34、术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
35、术语“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够通过现有技术手段和实验条件下(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
36、术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理条件下可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理条件下可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
37、一方面，本发明提供了一种化合物，具有通式i的结构：
38、
39、其中：
40、x＝o或s；
41、sug为核糖基或核糖基替代基；
42、pg为烷基及其衍生的烷基基团，或者芳基及其衍生的芳基基团等。
43、pa为衍生自rnai药物的磷酸酯部分，或硫代磷酸酯部分，或亚磷酰胺；
44、r1、r2可独立任选为h，f，或甲基；
45、bx为杂环碱基，优选地为非常规碱基。
46、在通式i的基础上，所述的化合物具有通式ii或通式iii的结构：
47、
48、或其内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体等形式；
49、其中：
50、x＝o或s；通式ii和通式iii中的所有x可分别独立为o或s；
51、pg为烷基及其衍生的烷基基团，或者芳基及其衍生的芳基基团等；
52、y任选为h，oh，f，och3，och2sch3，och2och2ch3，或och2ch2conhr(r为h，或c1-c3的烷基)等；
53、pa为衍生自rnai药物的磷酸酯部分，或硫代磷酸酯部分，或亚磷酰胺；
54、r1、r2可独立任选为h，f，或甲基；
55、bx为杂环碱基。
56、优选地，所述的bx为非常规碱基，所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基。所述的常规碱基指a、c、g、t、或u。所述的杂环碱基均可以包含保护基团。
57、进一步优选地，所述的非常规碱基包括但不限于下列含氮杂环中的一种：
58、
59、优选地，所述的通式中的pa为亚磷酰胺，所述的化合物为亚磷酰胺核苷酸单体，所述的化合物具有以下结构之一：
60、
61、所述的化合物中pom指(新戊酰氧基)氧甲基，bz为苯甲酰基。
62、同时，本发明提供了能够转化为以上4种化合物的通式为iv、v、vi或vii的化合物：
63、
64、其中pg’为羟基保护基团，具体为硅烷基以及硅烷基衍生物保护基，以及烷基酰基类、芳基酰基类、苄醚类、三苯甲基类保护基等。
65、再一方面，本发明提供了5’-末端携带前述修饰核苷酸单体的rnai分子。
66、优选地，所述的修饰核苷酸单体为5’-修饰核苷酸。
67、进一步地，所述5’-修饰核苷酸的修饰点位于核苷酸糖基的5’-碳(或位于核糖替代基的相应位置)上的基团部分。
68、优选地，所述的修饰核苷酸单体可以连接在双链rnai分子的反义链；优选地，连接在双链rnai分子的反义链的5’-末端1号位，用于改善sirna的成药性。
69、优选地，所述的rnai分子选自以下通式之一：
70、
71、其中，所有x分别独立为o或s；
72、sirna为双链的small interfering rna分子，结构如下：
73、正义链：5’-nnnnnnnn……nnnnnnnn-3’；
74、反义链：3’-nnnnnnnn……nnnnnnnn1-5’；
75、sirna双链结构中的n表示核苷酸单体；本发明涉及的5’-修饰核苷酸单体共价偶连在反义链5’-末端n1位置；即新型的核苷酸单体连接在sirna反义链5’-末端；
76、sirna结构示意图见图4，黄色末端位置为sirna反义链5’-端，即本发明所述的5’-修饰核苷酸单体所在位置。
77、y代表h、oh、f、och3、och2sch3、och2och2ch3或och2ch2conhr(r为h，或c1-c3的烷基)等。
78、所述通式中sp3 c-h或sp2 c-h的h原子可以任意被d或f原子替代。
79、本发明所述的5’-修饰核苷酸单体可增强sirna分子中反义链5’-末端对核酸酶降解的抵抗作用。不仅如此，鉴于rnai药物反义链的5’-末端磷酸化状态直接影响其与risc装载效率，因此，在反义链5’-末端的核苷酸上直接引入稳定的膦酸基团，可显著提高反义链的risc装载效率，增强靶基因的沉默效率和干扰rnai分子的时效性。
80、又一方面，本发明提供前述化合物或rnai分子在制备rnai药物中的应用。
81、所述的rnai药物中包括前述的rnai分子或者通过前述化合物进行的制备。
82、在一些表述中，本发明中的rnai药物也称为rnai引发剂。
83、所述的化合物通过修饰sirna进行rnai药物制备。
84、所述的sirna可以是本领域已知或未知的。
85、本发明包含5’-修饰核苷酸的rnai药物分子也可以与galnac载体或肽类的配体缀合。
86、本发明包含5’-修饰核苷酸的rnai药物分子也可以与聚乙二醇(peg)或脂质类(如胆固醇)共价偶联。
87、本发明包含5’-修饰核苷酸的rnai药物分子也可以通过脂质纳米颗粒(lnp)或多肽纳米颗粒(pnp)将rnai分子递送至作用细胞产生相应的药理作用。
88、本发明还提供了包含前述rnai分子的缀合物、医药组合物、细胞或试剂盒。
89、本发明同时提供了包括前述的rnai分子或者通过前述的化合物进行制备的rnai药物。
90、在一些实施方式中，会使用至少一种包含5’-修饰核苷酸的所述rnai药物，来制备用于会从基因表达的减少或抑制中获益的对象的治疗药物组合物(即药品)。这些药物组合物用于在细胞、组织或生物体中抑制基因的表达。
91、就疾病治疗或药物的制剂化或用于治疗疾病的组合物而言，包含一个或多个5’-修饰核苷酸的rnai药物之类的表达抑制性寡核酸。
92、如本发明它处所讨论，例如，核糖基替代基部分可以与5’-修饰核苷酸的膦酸修饰方式联合使用，以将五元呋喃糖环改变成能够取代五元呋喃糖环的不同结构，例如吗啉基、环己烯基、环己六醇、或开环的结构等。这样的改变落在本发明所述的发明范围内。
93、rnai药物、靶向性配体和寡核酸递送
94、已证明，具有与靶核酸至少部分互补的序列的寡核酸(例如rnai药物)在体外和体内均可改变所述靶核酸的功能和活性。
95、在一些实施方式中，包含本发明所述的5’-修饰核苷酸的rnai药物是双链的。就双链rnai药物而言，所述rnai药物的正义和反义链的长度独立地为16-30个核苷酸。在一些实施方式中，双链rnai药物包含彼此至少部分互补(至少70％互补)的正义链和反义链。反义链包含具有与靶mrna中的序列完美互补(100％互补)或至少部分互补(至少85％互补)的序列的区域。正义和反义链可以是相同长度也可以是不同长度。
96、在一些实施方式中，正义链的长度为约19个核苷酸，而反义链的长度为约21个核苷酸。在一些实施方式中，正义链的长度为约21个核苷酸，而反义链的长度为约23个核苷酸。正义链和反义链之间的完美或部分互补区域通常为15-25个核苷酸的长度，且位于反义链的5’-端或附近(例如该区域距离反义链的5’-端1、2、3或4个核苷酸，其不完美或部分互补)。在一些实施方式中，5’-修饰核苷酸是双链rnai药物反义链的5’-端上的末端核苷酸。
97、在一些实施方式中，5’-修饰核苷酸连接在rnai药物的末端，并提升risc loading效率，进而提高rnai药物的成药性能。在一些实施方式中，本发明所述的在末端包含5’-修饰核苷酸的rnai药物通过递送至细胞，能够在体外或体内通过rna干扰(rnai)的生物过程抑制或敲减靶基因的表达。
98、就双链rnai药物而言，如果存在其它的正义链核苷酸，则其可以与靶mrna中的相应序列相同或不相同。如果存在其它的反义链核苷酸，则其可以与相应的正义链的其它核苷酸(如果存在的话)互补或不互补。
99、在一些实施方式中，本发明所述的包含末端5’-修饰核苷酸的双链rnai药物的正义链和反义链含有相同数量的核苷酸。在一些实施方式中，本发明所述的rnai药物的正义和反义链含有不同数量的核苷酸。
100、在一些实施方式中，正义链和反义链均含有1至4个硫代磷酸酯连接。
101、本发明所述的rnai药物用本领域常用的方法合成。双链rnai药物可通过反义链和正义链一起退火而形成。
102、在一些实施方式中，包含5’-修饰核苷酸的rnai药物抑制细胞、组织或体内中的靶mrna的表达。在一些实施方式中，将治疗有效剂量的本发明所述的包含5’-修饰核苷酸的rnai药物给予体内，从而抑制体内中的靶mrna的表达。
103、在一些实施方式中，所述rnai药物用于治疗、预防或控制与靶mrna的表达相关的临床症状表现。在一些实施方式中，将治疗或预防有效剂量的一种或多种rnai药物给予需要这种治疗、预防或控制的对象。
104、本发明所述的包含5’-修饰核苷酸的rnai药物以及包含本发明所述的rnai药物的组合物，可以使用本领域已知的寡核苷酸递送技术递送至细胞、组织、或相关器官。一般来说，可以将本领域适合于(在体外或体内)递送核酸分子的任意方法，应用于本发明所述的包含一个或多个5’-修饰核苷酸的rnai药物。
105、在一些rnai药物为双链的实施方式中，靶向性配体或靶向性基团、连接基团或递送载体与正义链共价连接。在一些实施方式中，靶向性配体、连接基团和/或递送载体直接地或通过接头间接地与正义链的3’-或5’-末端共价连接。
106、在一些实施方式中，靶向性配体或靶向性基团含有二到四个末端n-乙酰基半乳糖胺(galnac)，其与包含一个或多个5’-修饰核苷酸的rnai药物连接。已知三触角型(galnac)结合asgpr的亲和性大于二触角型或单触角型结构(connolly等，j.biol.chem.,1982,257,939-945)。
107、本发明涉及的一类修饰的新型核苷酸，能为rnai药物分子提供改善其risc装载效率、提高代谢稳定性和增强对靶基因mrna的沉默效力，同时还能延长rnai药物分子的时效性，因此能显著改善rnai药物分子(如sirna)的成药性。
1.一种化合物，其特征在于，具有通式i的结构：
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，具有通式ii或通式iii的结构：
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述的bx为杂环碱基，优选地为非常规碱基，所述的非常规碱基为除常规核苷碱基之外的非常规嘌呤、嘧啶或含氮杂环碱基；所述的常规核苷碱基指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
4.根据权利要求3所述的化合物，其非常规碱基bx为选自下列含氮杂环中的一种：
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于所述的pa为亚磷酰胺，所述的化合物为亚磷酰胺核苷酸单体，所述的化合物具有以下结构之一：
6.一种化合物，其特征在于，选自通式为iv、v、vi或vii：
7.一种末端携带权利要求1-6任一项所示修饰核苷酸单体的rnai分子。
8.根据权利要求7所述的rnai为rnai双链分子。
9.根据权利要求8所述的rnai分子，其特征在于，修饰核苷酸单体连接在反义链5’-末端1号位。
10.根据权利要求9所述的rnai分子，其特征在于，选自以下通式之一：
11.根据权利要求10所述的rnai分子，其特征在于，所述通式中sp3 c-h或sp2 c-h的h原子可被d(氘)或f(氟)原子替代。
12.权利要求1-6任一项所述的化合物或权利要求8-11任一项所述的rnai分子在制备rnai药物中的应用。
13.包括权利要求7-11任一项所述的rnai分子的缀合物、医药组合物、细胞或试剂盒。
14.通过权利要求1-6任一项所述的化合物制备的rnai药物。
