本发明属于代谢工程和合成生物学领域，涉及一种生产d-泛酸的酵母菌株及其应用。
背景技术：
1、d-泛酸，又名维生素b5，是辅酶a和酰基载体蛋白生物合成的重要前体，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢，是人体必需的维生素。d-泛酸缺乏可导致脱发、神经退行性疾病和生长迟缓等疾病或症状，d-泛酸的重要生理作用使其在医药、饲料、食品、化妆品等方面广泛应用，具有巨大的市场价值。目前d-泛酸是通过化学与微生物法进行工业生产，由于化学合成过程会产生大量的含氰化物废水，造成严重的环境污染，一旦发生停产或产能收缩，对市场供应和价格预期影响极大。微生物发酵生产化学品是一种绿色可持续的手段，已经被用于多种高价值化合物的工业合成。
2、目前有关d-泛酸有关的代谢工程研究主要集中在以原核宿主为底盘细胞生产d-泛酸，并且高效发酵获得d-泛酸依赖于前体β-丙氨酸的投喂或在发酵原料中添加复杂的营养成分。而未有研究以真核宿主为底盘，通过代谢工程系统性合成d-泛酸的研究。而酿酒酵母作为一种真核宿主，已经被成功广泛用于合成多种高价值化合物，以低成本发酵原料且无前体投喂的方法实现酿酒酵母中进行d-泛酸的代谢工程研究具有较大的价值。
技术实现思路
1、本发明的首要目的在于提供一种生产d-泛酸的酵母菌株。
2、本发明的另一目的在于提供上述生产d-泛酸菌株的应用。
3、本发明的再一目的在于提供利用上述菌株生产d-泛酸的方法。
4、本发明的目的通过下述技术方案实现：
5、一种生产d-泛酸的酵母菌株，其以酿酒酵母为宿主，异源表达如下基因：编码d-泛酸合酶的panc基因，编码天冬氨酸脱羧酶的pand基因，编码乙酰乳酸合酶的ilv2、ilv6基因，编码3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶的ecm31基因，编码酮酸还原异构酶的ilvc基因，编码二羟酸脱水酶的ilvd基因，编码2-脱氢泛解酸还原酶的pane基因。
6、在一些实施方案中，上述基因的来源、编码蛋白、经密码子优化的核苷酸序列如下：
7、编码d-泛酸合酶的panc基因为来源于corynebacterium glutamicum的cgpanc基因，其编码的d-泛酸合酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、编码天冬氨酸脱羧酶的pand基因为来源于tribolium castaneum的tcpand基因，其编码的天冬氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no.3所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、编码乙酰乳酸合酶的ilv2、ilv6基因为来源于saccharomyces cerevisiae的scilv2、scilv6基因；scilv2、scilv6编码的乙酰乳酸合酶的氨基酸序列如seq id no.5、7所示，scilv2、scilv6经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.6、8所示。
10、编码3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶的ecm31基因为来源于s.cerevisiae的scecm31基因，其编码的3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如seq id no.9所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.10所示。
11、编码酮酸还原异构酶的ilvc基因为来源于pseudomonas aeruginosa的pailvc基因基因，其编码的酮酸还原异构酶的氨基酸序列如seq id no.11所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.12所示。
12、编码二羟酸脱水酶的ilvd基因为来源于bacillus subtilis的bsilvd基因，其编码的二羟酸脱水酶的氨基酸序列如seq id no.13所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.14所示。
13、编码2-脱氢泛解酸还原酶的pane基因为来源于mycobacterium tuberculosis的mtpane基因，其编码的2-脱氢泛解酸还原酶的氨基酸序列如seq id no.15所示，该基因经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.16所示。
14、在一些实施方案中，上述基因的拷贝数为ilv2：ilv6：ilvc：ilvd：ecm31：pane：panc：pand＝3：3：3：3：3：3：2：1。
15、在一些实施方案中，所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其进行了如下改造中的至少一种：基因组上的leu2基因被cgpanc基因替换掉；bat1基因被mae1基因替换掉；leu4基因被pos5基因替换掉；gal80基因被his3、leu2、ura3、trp1基因替换掉。进一步地，所述的酵母菌株xi-5位点插入cgpanc；x-3位点插入tcpand；x-4位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；xi-3位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；xii-1位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；所述基因pos5构建在组成型启动子下，组成型启动子为ptef1；除pos5外的其他基因均构建在半乳糖诱导的启动子下，所述的半乳糖诱导的启动子为pgal1、pgal7、pgal2或pgal10。
16、所述的酵母菌株优选为酿酒酵母(s.cerevisiae)cen.pk2-1d。
17、所述的gal80基因为酿酒酵母内涉及到半乳糖代谢和调控相关的基因。基因gal80转录的蛋白和gal4蛋白结合，阻止gal4蛋白对半乳糖代谢相关基因的转录激活作用。
18、所述的bat1基因为酿酒酵母内支链氨基酸氨基转移酶涉及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸合成，是d-泛酸合成的旁路途径。
19、所述的leu2/4基因为酿酒酵母内异丙基苹果酸合成酶涉及亮氨酸合成，是d-泛酸合成的旁路途径。
20、所述的mae1基因为酿酒酵母内苹果酸合成酶涉及丙酮酸合成，是d-泛酸合成的前体供给途径。
21、所述的pos5基因为酿酒酵母内nadh激酶涉及nadph循环合成，是d-泛酸合成的辅因子供给途径。
22、所述的his3基因为酿酒酵母内磷酸咪唑甘油脱水酶涉及组氨酸的合成，ura3为酿酒酵母内二氢乳清酸脱氢酶涉及嘧啶合成，trp1基因为酿酒酵母内多功能色氨酸生物合成酶涉及色氨酸合成，以上基因可提供酿酒酵母必需元素合成。
23、上述的d-泛酸合成路径关键酶酶组合而成的异源杂合路径，协调路径合成中的流量平衡，进而组成较为优异的异源酶杂合d-泛酸合成路径。
24、所述的生产d-泛酸的酵母菌株，优选通过包含如下步骤的方法构建得到：
25、(1)使用crispr技术在酿酒酵母基因组上整合cgpanc基因，并使用pgal10启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::pgal10-cgpanc。
26、(2)在(1)得到的菌株基因组上整合tcpand基因，并使用pgal10启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand。
27、(3)在(2)得到的菌株基因组上整合三个拷贝的scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane基因，并使用pgal10、pgal1、pgal7、pgal2启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand,3×pgal1-scilv2,3×pgal10-scilv6,3×pgal7-pailvc,3×pgal2-bsilvd,3×pgal10-scecm31,3×pgal1-mtpane。
28、(4)在(3)得到的菌株基因组上增加一个拷贝cgpanc基因，并使用pgal10启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::2×pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand,3×pgal1-scilv2,3×pgal10-scilv6,3×pgal7-pailvc,3×pgal2-bsilvd,3×pgal10-scecm31,3×pgal1-mtpane。
29、(5)在(4)得到的菌株基因组上敲除bat1基因并插入mae1基因，并使用pgal10启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::2×pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand,3×pgal1-scilv2,3×pgal10-scilv6,3×pgal7-pailvc,3×pgal2-bsilvd,3×pgal10-scecm31,3×pgal1-mtpane,bat1δ::pgal10-mae1。
30、(6)在(5)得到的菌株基因组上敲除leu4基因并插入pos5基因，并使用ptef1启动子进行强表达，得到cen.pk2-1d::2×pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand,3×pgal1-scilv2,3×pgal10-scilv6,3×pgal7-pailvc,3×pgal2-bsilvd,3×pgal10-scecm31,3×pgal1-mtpane,bat1δ::pgal10-mae1,leu4δ::ptef1-pos5。
31、(7)在(6)得到的菌株基因组上敲除gal80基因并回补缺陷型his3、leu2、ura3、trp1基因，得到cen.pk2-1d::2×pgal10-cgpanc,pgal10-tcpand,3×pgal1-scilv2,3×pgal10-scilv6,3×pgal7-pailvc,3×pgal2-bsilvd,3×pgal10-scecm31,3×pgal1-mtpane,bat1δ::pgal10-mae1,leu4δ::ptef1-pos5,gal80δ::his3、leu2、ura3、trp1，即得到所述的生产d-泛酸的酵母菌株。
32、上述生产d-泛酸的酵母菌株在生产d-泛酸中的应用。
33、利用上述生产d-泛酸的酵母菌株生产d-泛酸的方法，包含如下步骤：将上述生产d-泛酸的酵母菌株接入含碳源的培养基中进行发酵得到d-泛酸。所述的碳源优选为葡萄糖或乙醇。
34、本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：选用工业上常用的模式菌株酿酒酵母作为宿主菌株，该菌株具有遗传改造简单，同时在工业生产上具有明显抗逆性优势。本发明首先特征性比较了酿酒酵母中半乳糖诱导相关启动子的表达强度，选取较强的诱导型启动子pgal1、pgal2、pgal7和pgal10用于控制d-泛酸合成相关的基因表达。同时通过敲除调控半乳糖相关的基因gal80，使得构建的菌株无需添加诱导剂半乳糖可以合成d-泛酸产物。同时本发明通过密码子优化合成不同来源的d-泛酸合成相关的基因，成功实现了在异源真核宿主内进行表达。随后本发明敲除bat1和leu4基因，削减旁路代谢。再通过过表达mae1增加前体丙酮酸合成。最后过表达pos5增加辅因子合成。通过这些技术，在发酵中不需要加入β-丙氨酸前体，以葡萄糖或乙醇为碳源，使本发明的酵母菌株能够合成4.1g/l的d-泛酸，具有很好的工业应用前景。
1.一种生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：所述的菌株以酿酒酵母为宿主，异源表达如下基因：编码d-泛酸合酶的panc基因，编码天冬氨酸脱羧酶的pand基因，编码乙酰乳酸合酶的ilv2、ilv6基因，编码3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶的ecm31基因，编码酮酸还原异构酶的ilvc基因，编码二羟酸脱水酶的ilvd基因，编码2-脱氢泛解酸还原酶的pane基因。
2.根据权利要求1所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：各基因的拷贝数为ilv2：ilv6：ilvc：ilvd：ecm31：pane：panc：pand＝3：3：3：3：3：3：2：1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：所述的菌株以酿酒酵母为宿主，进行了如下改造中的至少一种：酿酒酵母基因组上的leu2基因被cgpanc基因替换掉；bat1基因被mae1基因替换掉；leu4基因被pos5基因替换掉；gal80基因被his3、leu2、ura3、trp1基因替换掉。
6.根据权利要求5所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：所述的酵母菌株的xi-5位点插入cgpanc；x-3位点插入tcpand；x-4位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；xi-3位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；xii-1位点插入scilv2、scilv6、pailvc、bsilvd、scecm31、mtpane；所述基因pos5构建在组成型启动子下，除pos5外的其他基因均构建在半乳糖诱导的启动子下。
7.根据权利要求6所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：所述的半乳糖诱导的启动子为pgal1、pgal7、pgal2或pgal10，组成型启动子为ptef1。
8.根据权利要求1所述的生产d-泛酸的酵母菌株，其特征在于：所述的酵母菌株为酿酒酵母cen.pk2-1d。
9.权利要求1-8任一项所述的酵母菌株在生产d-泛酸中的应用。
10.一种利用权利要求1-8任一项所述的酵母菌株生产d-泛酸的方法，其特征在于，包含如下步骤：将权利要求1-8任一项所述的酵母菌株接入含碳源的培养基中进行发酵得到d-泛酸。
