本发明属于生物工程，特别涉及到一种无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的制备方法及其在生产非天然氨基酸方面的应用。
背景技术：
1、苯丙氨酸脱氢酶(pdh)是一种氧化还原酶类，其正反应可在nad+存在的情况下催化l-苯丙氨酸氧化脱氨基生产苯丙酮酸、nadh和nh4+；逆反应可催化苯丙酮酸、nadh和氨合成相应的氨基酸。pdh这一催化特性使其已成为临床检测苯丙酮尿症血液中苯丙氨酸含量的试剂用酶。此外，pdh还可通过还原胺化反应合成非天然氨基酸，但在这些反应过程中需要消耗大量昂贵的辅因子nadh。因此，利用甲酸脱氢酶(fdh)对pdh反应消耗的nad+进行回收利用，使反应循环持续进行。
2、然而，涉及到两种或多种游离酶的级联反应，由于其稳定性差、生产效率低的缺点，在工业应用中存在局限性。为了解决这些缺点，需要开发一种多酶共固定化策略，以提高贮藏稳定性、热稳定性和产量。
3、交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates，cleas)是一种无载体固定化技术，具有制备过程简单、对酶纯度要求低、单位体积活性高、特异性好、适用范围广泛等优点，尤其适用于多亚基酶的固定化。此外，还具有优异的有机溶剂和高温高压耐受性，表现出良好的贮藏稳定性和实际操作稳定性。然而目前尚未有利用cleas技术-无载体固定化酶技术应用于苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶固定化的研究。与单酶固定化相比，无载体共固定化酶提高辅酶nadh的使用效率，且可多次应用于工业生产，降低了生产成本。因此，研究一种节约成本、操作简单、性能优异且可实现工业化生产的无载体固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶是具有非常重要的现实意义。
技术实现思路
1、本发明的第一个目的在于提供一种无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的制备方法，来实现制备成本低、易于操作的固定化酶。
2、所述固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶按照如下方法制备：
3、(1)培养能够表达的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组菌株，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液重悬细胞并超声破碎，得到含有苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的细胞破碎液；
4、(2)通过离心去除细胞碎片，收集上清液，得到含有苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液，加入磷酸盐缓冲液稀释酶液；
5、(3)向步骤(2)中得到的酶液中加入沉淀剂，进行搅拌沉淀；
6、(4)向步骤(3)沉淀后的体系加入交联剂，进行搅拌交联；
7、(5)将步骤(4)交联后的溶液12000rpm离心10min除去上清，用磷酸盐缓冲溶液进行重复冲洗，冲洗直到洗涤液中检测不到酶活，得到交联苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶聚集体；
8、在发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶浓度均不低于20mg/ml；
9、在发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的体积比为0.7∶1.3、0.8∶1.2、0.9∶1.1、1∶1；
10、在发明的一种实施方式中，所述沉淀剂包括peg(10-50％)、硫酸铵(50-100％)；
11、在发明的一种实施方式中，所述沉淀是在3-6℃、转速150-250rpm沉淀30-100min；
12、在发明的一种实施方式中，所述交联剂为戊二醛(ga)，ga质量分数0.1-1.2％，交联时间30-110min，转速150-250rpm；
13、在发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶粗酶液的制备方法包括：将可以表达苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的bl21菌株接种到5ml lb培养基中，于37℃、220rpm条件下培养12h，之后以2％的接种量将上述菌液转移至250ml lb培养基中，于37℃、220rpm条件下培养2h；之后加2.5ml升iptg(0.5mm)转至16℃诱导20h；10000rpm离心10min收集菌体，去除上清后加入lysis(20mm的tris-hcl、0.5m的nacl、1mm的二硫苏糖醇)重悬菌体，超声破碎20min后10000rpm离心30min去掉破碎的菌体，得到含有苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶液。
14、本发明的第二个目的是提供上述无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在生产l-苯丙氨酸、苯丙酮酸和非天然氨基酸方面的应用。
15、在发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶浓度均不低于20mg/ml；
16、在发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的体积比为0.7∶1.3、0.8∶1.2、0.9∶1.1、1∶1；
17、在发明的一种实施方式中，催化反应时间10-60h，反应温度45-75℃，反应ph 6-11。
18、本发明的有益效果：
19、本发明提供了一种pdh-fdh的共固定化交联聚集体，具有成本低、易于操作、稳定性高、转化率高的优点。固定化酶的温度稳定性和ph耐受性均具有显著提高。以共固定化交联酶聚集体作为催化剂进行沙格列汀中间体((s)-3-羟基金刚烷基甘氨酸)的制备，产物得率均在90％以上；将固定化酶回收利用，重复使用5批次，酶活仍然保留初始酶活的50％以上，各批次产物得率均大于75％。本发明利用自身辅酶循环系统，无需外源辅酶添加，产品产率与纯度高，在沙格列汀手性药物中间体的工业化生产中具有极高的应用价值。
1.一种无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，其特征在于，所述交联苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶聚集体按照如下方法制备：
2.如权利要求1所述的无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的制备条件如下：
3.权利要求1所述的无载体共固定化苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在生产非天然氨基酸方面的应用。
