本发明属于骨组织工程领域及生物材料领域，具体涉及一种仿生多级球状矿化胶原支架的制备方法及应用。
背景技术：
1、由于创伤、肿瘤、感染等原因引起骨缺损的发生率高，危害大。在临床治疗中，自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但存在来源有限、供体部位损伤等问题，限制了其临床运用。而人工合成植骨材料虽然来源广泛，但仍无法与天然骨组织的优异性能相媲美，究其原因在于人工合成材料的仿生度较差，未能准确模拟天然骨组织分级结构特征，更无法做到功能仿生。
2、早期的人工骨缺损修复支架材料多采用羟基磷灰石、钙盐颗粒与胶原复合物通过物理手段机械混合而成，如：专利cn100341588c公开了一种多孔胶原复合纳米羟基磷灰石人工骨的制备方法，虽然所制备材料能形成孔隙结构并具备一定力学性能，但远远不能与天然骨组织的刚度和韧性相比。一方面，天然骨组织的基本组成单位是纤维内矿化的胶原，其微观结构形式是胶原纤维作为有机分子模板，诱导无定形钙磷前体在其表面或内部发生有序沉积。基于此，有学者构建出纤维内矿化胶原支架以模拟骨组织纳米结构基础并用于骨修复，如：专利cn103830775b公开了一种高强度胶原基人工骨修复材料的制备方法，通过纳米钙磷盐与胶原分子自组装而形成一种接近人类皮质骨强度的骨修复材料，虽然该材料力学性能优异，但是实际运用中，常面临脆性增加，不能与术区完美贴合，操作性较差，甚至造成缺损区骨质不连等问题。因此，有研究利用柔性支架材料用于骨缺损修复，如：专利cn101234216b公开了一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/plga复合骨组织工程支架及其制备方法，虽然该材料为三维网洞状结构，有利于细胞在支架材料的表面黏附、增殖、分化，但是，这类植入材料常面临矿化速率不足、仿生结构差、成骨速度慢等问题。
3、天然骨组织矿化前沿处存在球状的矿化结构，矿化前沿处同时存在矿化区和未矿化区，这种球状矿化结构一方面有利于柔软胶原向坚硬矿化胶原过渡，另一方面也有利于胶原受力时局部应力中断和应力分散，使矿化前沿区具有较好机械性能及适宜韧性。此外，在骨组织的发育过程中，矿化前沿在胶原上不断推进，钙盐沉积呈现球状矿化结构并向周边不断辐射直至相互融合形成矿化胶原，从而进一步组装成精密的骨组织结构，故在生物矿化领域，矿化前沿是一种独特的存在，仿生骨修复材料若能做到再现矿化前沿处多层次的结构仿生具有重要意义，但在体外，目前从未有研究直接模拟出仿生多级矿化前沿结构用于骨缺损修复。
技术实现思路
1、为解决现有技术中的问题，本发明提出了一种仿生多级球状矿化胶原支架的制备方法及应用。本发明所述的仿生多级球状矿化胶原支架是由卵黄高磷蛋白-钙磷前体系统诱导i型胶原材料发生部分胶原纤维内矿化而形成的。
2、本发明的另一目的在于提供上述仿生多级球状矿化胶原支架的制备方法，具体技术方案包括如下步骤：
3、1)室温称量片状结晶样卵黄高磷蛋白固体；
4、2)将钙源加入到缓冲液中配置钙缓冲液，将磷源加入到缓冲液中配置磷缓冲液；所述缓冲液的ph均为7.2-7.5；
5、3)将钙缓冲液和磷缓冲液依次加入到步骤1)的卵黄高磷蛋白中，得到卵黄高磷蛋白-钙磷前体系统；所得卵黄高磷蛋白-钙磷前体系统中，钙、磷摩尔浓度比为1.67:1～2.14:1；卵黄高磷蛋白的浓度为37.5-300μg/ml；
6、4)将i型胶原材料加入到前述卵黄高磷蛋白-钙磷前体系统，进行体外矿化；矿化结束后，得到支架材料，将支架材料捞出，干燥，获得仿生多级球状矿化胶原支架材料。
7、作为本发明的优选方案，步骤2)中，所述钙源为氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙中的一种或多种，所述磷源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种；所述缓冲液为tris-hcl缓冲体系或hepes缓冲体系。
8、作为本发明的优选方案，步骤2)中，钙缓冲液中钙离子浓度为1.67mm-9mm，磷缓冲液中磷酸根离子浓度为1mm-4.2mm；
9、作为本发明的优选方案，步骤3)中，将钙缓冲液和磷缓冲液加入到卵黄高磷蛋白中的顺序为先加入钙缓冲液，再加入磷缓冲液；其中，钙缓冲液和磷缓冲液的加入体积相等。
10、作为本发明的优选方案，步骤4)中，所述i型胶原材料来源于多层鼠尾胶原模型、重组鼠尾胶原模型、火鸡肌腱胶原模型、重组牛跟腱来源胶原模型或脱矿牙本质胶原模型。
11、作为本发明的优选方案，步骤4)中，体外矿化时间为0.5天-7天，矿化温度为24℃-37℃。
12、本发明还提供了一种前述方法制备得到的仿生多级球状矿化胶原支架材料。
13、作为本发明的优选方案，所述支架材料矿化结构特点为多级球状，所述支架材料同时存在矿化区和未矿化区，矿化区胶原发生纤维内矿化，钙磷沉积后质地变硬，未矿化区胶原纤维保持原有节律性条带结构，质地偏软。
14、根据本发明方法制备的仿生多级球状矿化胶原支架材料具备优越的骨诱导性能、良好的机械性能，且无细胞毒性，可直接或间接用作骨缺损修复或骨组织工程支架材料。
15、本发明相较于现有技术而言，具有以下增益效果。
16、本发明所述仿生多级球状矿化胶原支架材料制备方法简单，流程简洁。所述支架是由卵黄高磷蛋白-钙磷前体系统作为矿化液诱导i型胶原发生部分胶原纤维内矿化而形成的，其矿化结构产生的主要原因在于卵黄高磷蛋白稳定的钙磷前体系统的制备技术存在显著的技术敏感性，只有在特定的卵黄高磷蛋白-钙磷离子浓度及配比条件下，才可形成独特的矿化结构及拥有高效的矿化速率。究其根本原因在于，卵黄高磷蛋白稳定的钙磷前体系统的形成及调控机理具有创新性，与以往聚合物稳定钙磷前体或磷蛋白稳定钙磷前体机理存在显著不同。其机制主要体现在，卵黄高磷蛋白可在特定的矿化体系中发生蛋白质构象的改变(如二级结构β-折叠的比例变化)，进而锚定钙磷离子形成独特的卵黄高磷蛋白稳定的钙磷自组装聚集体，该聚集体能够与胶原纤维发生快速吸附并形成独特的球状吸附区，最终诱导胶原形成独特球状矿化结构及具备高效矿化速率。上述卵黄高磷蛋白-钙磷前体的形成机理及调控胶原矿化机理未曾在矿化领域被报道，存在明显的机制创新，基于此机制得到的矿化产物(仿生多级球状矿化胶原支架)及矿化速率(12小时内完成单根胶原纤维内矿化)与以往研究存在不同。
17、此外，所述支架与其他基于钙磷矿物制备的矿化胶原支架相比，后者多为物理手段机械混合及锻造烧结而成，胶原纤维表现为完全矿化，质地偏硬，而本发明所述支架胶原矿化区和未矿化区并存，可实现软硬区同时分布。一方面，矿化区钙磷沉积后胶原质地变硬，其矿化模式与自然界中生物体矿化前沿区的球状矿化模式一致，同时矿化区胶原硬度高，韧性好，当其作为骨修复材料或骨组织工程材料应用于局部骨缺损部位时，矿化区胶原可作为受力部分发挥承重、支撑作用。另一方面，未矿化区胶原纤维保持原有节律性条带结构，质地软，未矿化区胶原在特定诱导条件下可待进一步发生矿化，形成质地硬的矿化胶原，当其作为骨修复材料或骨组织工程材料应用于局部骨缺损部位时，未矿化胶原可作为局部的应力分散区，中断缺损部位过大的应力刺激。另外，骨缺损部位组织的修复过程本质上为软组织向硬组织的逐步改建过程，现有的矿化胶原支架多为完全矿化，其在实际应用过程中往往存在骨质不连、难塑形的问题。本发明所述矿化胶原支架未矿化区与骨缺损处接触，其经诱导后未矿化区胶原逐步变硬的同时可与骨缺损区软组织嵌合并促进其改建从而实现材料与骨缺损界面质地从软到硬的过渡，这种软硬兼备的中间态材料更符合生物体天然骨形成情况，对于研发结构和功能双向仿生的人工骨修复材料具有重要意义，本发明所述仿生多级球状矿化胶原支架应用前景良好。
1.一种仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述钙源为氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙中的一种或多种，所述磷源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或多种；所述缓冲液为tris-hcl缓冲体系或hepes缓冲体系。
3.根据权利要求1所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，步骤2)中，钙缓冲液中钙离子浓度为1.67mm-9mm，磷缓冲液中磷酸根离子浓度为1mm-4.2mm。
4.根据权利要求3所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将钙缓冲液和磷缓冲液加入到卵黄高磷蛋白中的顺序为先加入钙缓冲液，再加入磷缓冲液；其中，钙缓冲液和磷缓冲液的加入体积相等。
5.根据权利要求1所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述i型胶原材料来源于多层鼠尾胶原模型、重组鼠尾胶原模型、火鸡肌腱胶原模型、重组牛跟腱来源胶原模型或脱矿牙本质胶原模型。
6.根据权利要求1所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，步骤4)中，体外矿化时间为0.5天-7天，矿化温度为24℃-37℃。
7.一种权利要求1-6任一项所述方法制备得到的仿生多级球状矿化胶原支架材料。
8.根据权利要求7所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料，其特征在于，所述支架材料同时存在矿化区和未矿化区，矿化区胶原发生纤维内矿化，钙磷沉积后质地变硬，未矿化区胶原纤维保持原有节律性条带结构，质地偏软。
9.权利要求7所述的仿生多级球状矿化胶原支架材料直接或间接用作骨缺损修复或骨组织工程支架材料的应用。
