一、本发明涉及生物，特别是一种耐热α-半乳糖苷酶突变体及其应用。
背景技术：
0、二、背景技术
1、自然界中产α-半乳糖苷酶的微生物很多，原菌发酵产酶的产量高低不一，有的还需要特定的诱导条件，低产量和高成本使得该方法不适宜用于工业化生产，工程菌就对比起来就有较大的优势，找到高表达且活性高的α-半乳糖苷酶基因并进行克隆表达的方法受到了国内外研究者的青睐。国内外对这一方面的研究都有了一定的进展。α-半乳糖苷酶基因工程表达系统主要有大肠杆菌，酵母，枯草芽孢杆菌和昆虫等。但由于大肠杆菌缺乏对真核蛋白质的修饰加工系统，细胞周质含有多种内毒素等缺点不利于进行真核生物源蛋白的表达。目前，利用毕赤酵母来生产α-半乳糖苷酶的研究较多。比如来自bispora sp.mey-1、penicillium sp.f63、rhizomucor miehei等的α-半乳糖苷酶基因都已在酵母中实现了有效的胞外表达，在甲醇诱导96h后，利用pnpg法测的酶活分别为1.5u/ml，111u/ml和240u/ml。
2、在饲料中添加α-半乳糖苷酶不仅可以解决豆粕型饲料中抗营养因子(多聚糖和低聚糖等)的问题，对提高豆粕蛋白能量利用率及有改善消化都有较明显的效果。酶在加工应用过程中要先经受原料混合、加工高温制粒后才在动物胃肠道溶解发生作用，所以酶制剂的温度和稳定性倍受关注。
3、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-gal，ec 3.2.1.22)能够将天然的或人工底物如：蜜二糖、水苏糖、人b型红细胞抗原和pnpg等特异性地水解，使底物中的非还原性末端α-1,6-半乳糖苷键断裂，从而释放出位于底物末端的半乳糖残基。单胃动物肠道内没有α-半乳糖苷酶，所以不能吸收利用玉米-豆粕型饲料里面含有的α-半乳糖苷类物质等抗营养因子。将α-半乳糖苷酶作为饲用酶制剂，可以消除饲料中抗营养因子带来的不良反应，并且能提高饲料的利用率和单胃动物的进食量。
4、但是目前的α-半乳糖苷酶的传统生产方式主要是从动物、植物中提取和利用微生物发酵进行生产，这些传统方法都普遍存在着不少或大或小的问题，例如：酶的活性不高、生产的效率不高、酶的热稳定性不好、提取的工艺复杂等等，在实际工业化饲料生产中，α-半乳糖苷酶受到了耐温性等方面的约束和限制，因此，如何获得耐温性提高的α-半乳糖苷酶是目前亟需解决的技术问题。
技术实现思路
0、三、
技术实现要素：
1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种耐热α-半乳糖苷酶突变体及其应用，可有效解决现有技术中酶的热稳定性不好的问题。
2、本发明解决的技术方案是，所述的α-半乳糖苷酶突变体来自人工合成的费氏弧菌(fecheri)的一个α-半乳糖苷酶基因gal27a，利用易错聚合酶链式反应(pcr)技术对构建的表达质粒pgapzαagal27a进行随机突变，将突变文库转化至毕赤酵母(pichia pastoris)gs115，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。
3、该耐热性提高的α-半乳糖苷酶突变体为t32a或g22s，t32a的氨基酸序列如seq idno：1所示，由氨基酸序列为seq id no：3的α-半乳糖苷酶ga127a的第32位的苏氨酸突变为丙氨酸获得；g22s的氨基酸序列如seq id no：2所示，由氨基酸序列为seq id no：3的α-半乳糖苷酶ga127a的第22位的甘氨酸突变为丝氨酸获得。
4、所述的突变体t32a的编码基因的核苷酸序列如seq id no：4所示；突变体g22s的编码基因的核苷酸序列如seq id no：5所示。
5、所述的α-半乳糖苷酶突变体的编码基因的表达载体或重组菌。
6、用于表达所述α-半乳糖苷酶的表达载体为质粒pgapzαa，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母gs115。
7、所述毕赤酵母工程菌对构建的表达质粒pgapzαa-gal27a进行随机突变，将突变文库转化至毕赤酵母(pichia pastoris)gs115中表达所得。
8、重组菌的制备方法，包括以下步骤：
9、1)通过设计引物，采用pcr方法扩增得到α-半乳糖苷酶突变体的编码基因gal27a；
10、2)将α-半乳糖苷酶突变体的编码基因gal27a进行酶切，连接至表达载体pgapzαa，得到表达质粒pgapzαa-gal27a；
11、3)以pgapzαa-gal27a为模板，进行聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，pcr)，以普通的taq酶作为聚合酶，在反应体系中除了加入等量(0.25mm)的4种dntp(datp、dctp、dgtp、dttp)外，再额外添加0.3-0.6mm的dgtp，以pgapzαa-gala为模板进行易错pcr，得pcr产物；
12、4)将步骤3)得到的pcr产物电转至转化入毕赤酵母gs115中，得到新型α-半乳糖苷酶的生产菌株gal27a-g22s；
13、5)纯化野生型gal27a-g22s突变体蛋白。
14、所述的生产菌株gal27a-g22s在发酵生产α-半乳糖苷酶中的应用。
15、所述的耐热性α-半乳糖苷酶突变体在制备动物饲料添加剂中的应用。
16、所述的耐热性α-半乳糖苷酶突变体在制备食品添加剂中的应用。
17、本发明通过分子生物学手段，利用易错pcr技术对现有的α-半乳糖苷酶进行随机突变，并筛选到耐热性提高的突变体t32a和突变体g22s，且这两个突变体在提高α-半乳糖苷酶耐热性的同时对其比酶活没有显著影响。
1.一种耐热性提高的α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述的α-半乳糖苷酶突变体为t32a或g22s，t32a的氨基酸序列如seq id no：1所示，由氨基酸序列为seq id no：3的α-半乳糖苷酶ga127a的第 32位的苏氨酸突变为丙氨酸获得；g22s的氨基酸序列如seq idno：2所示，由氨基酸序列为seq id no：3的α-半乳糖苷酶ga127a的第22位的甘氨酸突变为丝氨酸获得。
2.权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，突变体t32a编码基因的核苷酸序列如seq id no：4所示；突变体g22s编码基因的核苷酸序列如seq id no：5所示。
3.包含权利要求2所述的α-半乳糖苷酶突变体的编码基因的表达载体或重组菌。
4.权利要求3所述的表达载体，其特征在于，表达载体为质粒pgapzαa。
5.权利要求3所述的重组菌，其特征在于，宿主细胞为毕赤酵母gs115。
6.权利要求5所述的重组菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.权利要求5所述的制备方法得到的生产菌株gal27a-g22s在发酵生产α-半乳糖苷酶中的应用。
8.权利要求1所述的耐热性α-半乳糖苷酶突变体在制备动物饲料添加剂中的应用。
9.权利要求1所述的耐热性α-半乳糖苷酶突变体在制备食品添加剂中的应用。
