本发明属于天然药物含量测定，涉及一种栀子中西红花酸的提取衍生化检测方法，具体地说，它涉及以碱性水解剂与醇类混合溶液作为碱性提取衍生化溶剂的连续回流提取技术将西红花苷水解为西红花酸，结合高效液相色谱技术，检测栀子中西红花酸含量的新方法。
背景技术：
1、栀子是茜草科植物栀子gardeniajasminoides的干燥成熟果实，化学成分主要包括环烯醚萜苷类、单萜类、西红花苷类、三萜类、黄酮类及有机酸酯类等化合物。西红花苷类成分，是以含7个双键的共轭多烯为基本母核，包括西红花酸及其与不同糖基结合形成的糖苷，西红花酸是西红花苷的苷元。现代药理学研究表明西红花酸具有心脏保护、肝脏保护、神经保护、抗抑郁、抗病毒、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病和辅助改善记忆等作用，具有很高的临床应用价值。
2、西红花酸主要存在于番红花柱头和栀子果实中，其中栀子果实中西红花酸产量高、生产成本低且栀子在我国多个省份均有种植，故生产上常以栀子为起始原料大规模制备西红花酸，工艺路线一般是通过提取其中的西红花苷类成分，经过水解后再酸化得到西红花酸。对于起始原料及各步中间体的质量控制方法已有报道，但均存在各种缺陷，如中国药典2020版以栀子苷为指标性成分控制栀子药材质量，不适用于本工艺起始原料的质量控制；常规方法通过检测西红花苷-i和西红花苷-ii含量并考虑分子量差异将其换算成西红花酸含量，作为栀子药材和中间体质量评价指标，但该指标并未考虑到栀子中含有的其他种类西红花苷，不能准确反映栀子中所含西红花酸的总量，且市面上西红花苷对照品价格昂贵，纯度不够可靠及稳定性较差等特点也限制了此方法的应用。
3、“陈玉平等.rp-hplc法测定清脑宣窍方有效部位中藏红花酸含量.《北京中医药大学学报》,2004,(03):63-65。”公布了一种测定清脑宣窍方有效部位和栀子原药材中西红花酸含量的样品前处理方法。该方法采用75％甲醇-吡啶(94:6,v/v)混合溶剂作为提取介质，连续回流提取法处理样品。然而，值得注意的是，该方法使用的碱性试剂——吡啶，作为一种有机碱，在提取和衍生化过程中会引入潜在的干扰因素，影响检测，此外，吡啶的水解反应不完全，这也会对测定结果的准确性造成一定影响。
4、“梁华正等.反相高效液相色谱法同时测定西红花苷ⅰ和西红花酸.《东华理工大学学报(自然科学版)》,2012,35(04):402-406。”建立了一种同时测定栀子黄色素中西红花苷ⅰ和西红花酸含量的样品前处理方法，该方法采用氢氧化钠作为碱性水解剂，并以水作为提取溶剂，在60℃恒温水浴条件下进行提取衍生化。cn108203378a中也公布了一种从含有西红花苷的植物中提取西红花苷的方法，该方法采用氢氧化钠碱溶液作为提取溶剂，在30-80℃下搅拌反应0.5-6hr进行提取衍生化。cn101863754a也公布了一种从栀子中提取西红花酸的方法，该方法先向栀子粉末加入氢氧化钠碱水，加热提取衍生化，酸化后，再用乙酸乙酯和乙醚萃取。然而，由于西红花酸在水中几乎不溶，仅采用碱水作为提取溶剂必然导致其提取不完全。此外，30-80℃恒温水浴条件相对温和，不足以使西红花苷完全水解。
5、cn106905145a中公布了一种高纯度西红花酸的制备方法，先将栀子用水或乙醇提取，获得其水或乙醇的提取物后，再加入氢氧化钠水溶液在50℃下水解2.5小时进行衍生化。然而，西红花苷几乎不溶于水，西红花苷在碱性环境中溶解性和稳定性也更佳，且碱性条件可以帮助破坏植物细胞的结构，释放更多活性成分，故只用乙醇或水单独从植物中提取西红花苷，势必不能充分提取栀子中的西红花酸。
6、因此，有必要开发能够简单、高效并准确测定栀子中西红花酸总量的可靠分析方法。
技术实现思路
1、本发明目的在于克服现有技术的不足，建立一种更简单、更准确、成本更低的分析方法以测定栀子中西红花酸的含量，从而解决当前分析方法不能准确反映栀子中所含西红花酸总量的技术问题。本发明具体提供了一种以碱性水解剂与醇类混合溶液作为提取衍生化溶剂的连续回流提取技术，结合高效液相色谱的方法，可用于分析测定栀子中西红花酸总量。
2、为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为：
3、一种测定栀子中西红花酸含量的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
4、步骤s1：供试品溶液的制备：称取栀子粉末，加入碱性提取衍生化溶剂，采用连续回流法进行栀子粉末中西红花酸的提取和衍生化，固液分离，取液相，用溶剂a稀释制成栀子溶液，即为供试品溶液；
5、步骤s2：标准品溶液的制备：称取西红花酸标准品，用溶剂b溶解并稀释制成不同浓度的标准品溶液；
6、步骤s3：高效液相色谱法检测：分别取供试品溶液和标准品溶液采用高效液相色谱检测；
7、步骤s4：以西红花酸为参照物，采用标准曲线法或外标一点法计算栀子粉末中西红花酸的含量；
8、所述碱性提取衍生化溶剂为碱性水解剂与醇类的混合溶液，两者的体积比为1:4～1:1；所述碱性水解剂为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的一种；所述醇类为甲醇、乙醇中的一种。
9、在一些实施方式中，所述步骤s1中：所述栀子粉末为过四号筛的栀子粉末，所述栀子粉末的质量与碱性提取衍生化溶剂的体积比为0.1～0.3g:25ml；所述碱性提取衍生化溶剂为碱性水解剂与乙醇、碱性水解剂与甲醇的混合溶液中的一种，两者的体积比为1:4～1:1。
10、在一些实施方式中，所述碱性水解剂的浓度为0.5mol/l～2mol/l。
11、在一些实施方式中，所述溶剂a为dmso与甲醇的混合物、dmf与甲醇的混合物、dmso与乙醇、dmf与乙醇中的一种，两者的体积比为1:4～1:1。
12、在一些实施方式中，所述溶剂b为甲醇与dmso和碱性水解剂的混合物、甲醇与dmf和碱性水解剂的混合物、乙醇与dmso和碱性水解剂的混合物、乙醇与dmf和碱性水解剂的混合物中的一种，三者的体积比为80:15:5。
13、在一些实施方式中，所述溶剂a为dmso与甲醇的混合物，所述溶剂b为甲醇与dmso和碱性水解剂的混合物。
14、在一些实施方式中，所述连续回流法中加热回流时间为20min～80min；所述供试品溶液浓度为1mg/ml～3mg/ml。
15、在一些实施方式中，所述步骤s2中：所述标准品溶液中，标准品西红花酸的浓度为1.512～96.95μg/ml。
16、在一些实施方式中，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为agilentextend c18柱，参数为4.6mm×250mm，5μm、agilent eclipse xdb c18柱，参数为4.6mm×250mm，5μm、agilent eclipse xdb c18柱，参数为4.6mm×150mm，5μm中的一种。在一些实施例中，流动相为甲醇-水-乙酸，体积比为75:24.4～24.6:0.6～0.4，优选为75:24.5:0.5，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，优选为1.0ml/min，采取等度洗脱方法；检测波长为421nm～425nm，优选为423nm；柱温为25℃～35℃，优选为30℃；进样体积为10μl。
17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18、本发明建立以碱性水解剂和醇类混合溶液作为碱性提取衍生化溶剂的连续回流提取-高效液相色谱法对栀子中西红花酸含量的测定研究，具有准确度高、成本低、简单快速等优点，解决了当前分析方法不能准确反映栀子中所含西红花酸总量的技术问题。
1.一种测定栀子中西红花酸含量的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中：所述栀子粉末为过四号筛的栀子粉末，所述栀子粉末的质量与碱性提取衍生化溶剂的体积比为0.1～0.3g:25ml；所述碱性提取衍生化溶剂为碱性水解剂与乙醇、碱性水解剂与甲醇的混合溶液中的一种，两者的体积比为1:4～1:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性水解剂的浓度为0.5mol/l～2
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂a为dmso与甲醇的混合物、dmf与甲醇的混合物、dmso与乙醇、dmf与乙醇中的一种，两者的体积比为1:4～1:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂b为甲醇与dmso和碱性水解剂的混合物、甲醇与dmf和碱性水解剂的混合物、乙醇与dmso和碱性水解剂的混合物、乙醇与dmf和碱性水解剂的混合物中的一种，三者的体积比为80:15:5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂a为dmso与甲醇的混合物，所述溶剂b为甲醇与dmso和碱性水解剂的混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续回流法中加热回流时间为20min～80min；所述供试品溶液浓度为1mg/ml～3mg/ml。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中：所述标准品溶液中，标准品西红花酸的浓度为1.512～96.95μg/ml。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s3中高效液相色谱的色谱条件为：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，流动相为甲醇-水-乙酸，体积比为75:24.4～24.6:0.6～0.4，优选为75:24.5:0.5，流速为0.8ml/min～1.2ml/min，优选为1.0ml/min，采取等度洗脱方法；检测波长为421nm～425nm，优选为423nm；柱温为25℃～35℃，优选为30℃；进样体积为10μl。
