本发明涉及合成生物学技术，具体地，涉及一种解除氮限制的代谢调控方法及其应用，一种重组菌株以及一种生产赤霉酸的方法。
背景技术：
1、赤霉酸(gibberellin acid，ga3)是一四环二萜类化合物的天然植物生长激素，1935年由日本学者从水稻赤霉菌中分离得到，定名为赤霉酸。ga3的使用可以有效促进茎的伸长，且能够诱导促进开花以及穗粒外露，是我国目前农、林、园艺上应用最广泛的一种植物生长调节剂。
2、生产赤霉酸传统所采用的植物提取法和化学合成法受限于效率低、步骤复杂、污染严重等因素，因此很快被放弃。微生物发酵法因其原料可再生，绿色温和的特点逐渐成为研究的重点，目前藤仓赤霉菌液体发酵是工业生产ga3的唯一方式。但是在发酵生产ga3过程中，依然存在着很多难题，比如，当发酵培养基中的氮源比较丰富时，ga3生物合成受阻，当氮源即将耗尽时，ga3开始合成，这导致ga3在氮源丰富的发酵前期难以合成，延长了整个发酵周期并影响最终的产量。传统氮调控需要不断调整培养基中有机氮的浓度，但是氮源是支持微生物细胞生长的关键营养元素，很难实现精准调控。
3、随着分子生物学的发展，改造ga3生物合成途径使其与宿主细胞更加适配逐渐成为研究的重点。近年来关于藤仓赤霉菌胞内氮限制的报道很少，各种氮响应因子的作用机制也不清晰，还未发现能够有效解除高氮对ga3合成限制的分子生物学方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物培养基的高氮对目标产物合成限制的问题，提供一种解除氮限制的代谢调控方法、重组菌株及它们的应用和生产赤霉酸的方法，该调控方法能够解耦细胞生长与目标产物合成，使得目标产物的合成不受氮浓度的影响，缩短发酵时间，提高发酵产量，为实现目标产物的高效、快速合成奠定基础。
2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种解除氮限制的代谢调控方法，该方法包括以下步骤：在底盘菌株中增强乙酰辅酶a的通量以及异戊烯醇两步磷酸化利用途径的通量，并将底盘菌株中氮抑制型转录因子替换为组成型启动子，然后利用推拉策略增强目标产物合成的通量。
3、本发明创造性地将目标产物(例如，赤霉酸)的生物合成途径划分为三个模块，即乙酰辅酶a供应模块、前体异戊烯焦磷酸ipp与二甲烯丙基焦磷酸dmapp合成模块以及目标产物合成模块；在前两个模块引入异源的代谢途径，优势在于能够避免内源途径受到的氮限制约束的同时作为替代途径增加目标物的积累，解除了乙酰辅酶a和萜类前体物质(异戊烯焦磷酸ipp，二甲烯丙基焦磷酸dmapp)合成途径受到的氮调控；目标产物模块的基因启动子区域必须结合氮响应转录因子(area、areb)才能开启转录，替换内源的启动子功能元件能有效解除目标产物合成模块的氮限制；通过组合调控上述三个代谢模块，最终实现目标产物在底盘菌株(例如，藤仓赤霉菌)胞内的高效合成。
4、优选地，所述乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中外源引入乙酰辅酶a再生途径的关键酶的编码基因。
5、优选地，所述乙酰辅酶a再生途径选自丙酮酸-乙酸途径、丙酮酸-醛途径、丙酮酸甲酸裂解酶途径、乙酰辅酶a穿梭途径和非氧化戊糖-磷酸途径中的至少一者。
6、优选地，所述丙酮酸-乙酸途径的关键酶包括丙酮酸脱羧酶pdc和醛脱氢酶aldh，所述丙酮酸-醛途径的关键酶包括丙酮酸脱羧酶pdc和coa-乙酰化醛脱氢酶aad，所述丙酮酸甲酸裂解酶途径的关键酶包括丙酮酸甲酸裂解酶激活因子pfla和丙酮酸甲酸裂解酶pflb，所述乙酰辅酶a穿梭途径的关键酶包括肉碱乙酰转移酶cat2，所述非氧化戊糖-磷酸途径的关键酶包括磷酸酮酶pk和磷酸转乙酰酶pta。
7、优选地，所述pdc的编码基因ncbi编号为gene id:850733，aldh的编码基因ncbi编号为genbank:aj306960.1，aad的编码基因ncbi编号为gene id:87810809，pfla的编码基因ncbi编号为gene id:945517，pflb的编码基因ncbi编号为gene id:945514，cat2的编码基因ncbi编号为gene id:854965，pk的编码基因ncbi编号为gene id:37204730，pta的编码基因ncbi编号为gene id:936581。
8、优选地，所述异戊烯醇两步磷酸化利用途径的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中外源引入胆碱激酶ck和异戊烯磷酸激酶ipk两者的编码基因。
9、优选地，所述ck的编码基因ncbi编号为gene id:850824，所述ipk的编码基因ncbi编号为gene id:101250107。
10、优选地，所述氮抑制型转录因子包括转录因子area和转录因子areb，所述组成型启动子为启动子ptrpc。
11、优选地，所述转录因子area的ncbi编号为sequence id:y11006.1，所述转录因子areb的ncbi编号为genbank:am075623.1所述启动子ptrpc的核苷酸序列如seq id no：1所示。
12、优选地，所述氮抑制型转录因子替换为组成型启动子采用同源重组的方式。
13、优选地，所述目标产物合成的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中过表达至少一个目标产物合成模块关键酶的编码基因。
14、优选地，所述目标产物合成模块关键酶的编码基因为des，p450-4，p450-1，p450-2，ggs2，cps/ks和p450-3中的至少一个；更优选为des，p450-4，p450-1，p450-2，ggs2，cps/ks和p450-3。
15、优选地，所述所述des的ncbi编号为gene id:35407783，p450-4的ncbi编号为geneid:35407784，p450-1的ncbi编号为gene id:35407785，p450-2的ncbi编号为gene id:35407786，ggs2的ncbi编号为gene id:35407787，cps/ks的ncbi编号为gene id:35407788，p450-3的ncbi编号为gene id:35407789。
16、优选地，所述底盘菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为cctcc no:m20221848；所述目标产物为赤霉酸。
17、本发明第二方面提供一种重组菌株，该重组菌株由底盘菌株经上述的方法改造获得。
18、本发明第三方面提供所述的方法、所述的重组菌株在提高底盘菌株发酵生产目标产物的产量中的应用。
19、优选地，所述底盘菌株为藤仓赤霉菌，所述目标产物为赤霉酸。
20、优选地，所述藤仓赤霉菌的保藏号为cctcc no:m 20221848。
21、本发明第四方面提供一种生产赤霉酸的方法，该方法包括：按照上述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵，或者，将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。
22、优选地，所述发酵培养基含有：80-100g/l萄糖，10-15g/l脱脂豆粕，0.05-0.2g/lmgso4·7h2o和1-2g/l kh2po4。
23、优选地，所述发酵的条件至少包括：温度为20-35℃，转速为150-250rpm，时间为7-9天。
24、通过上述技术方案，本发明提供的解除氮限制的代谢调控方法基于异源基因的整合和氮调控启动子的替换，构建了新的乙酰辅酶a，异戊烯焦磷酸ipp与二甲烯丙基焦磷酸dmapp的合成途径，与内源途径会受到氮限制的约束不同，新的途径与胞内其他代谢途径正交，不仅能高效催化底物合成目标产物，还能够避免目标产物合成途径的氮调控；进一步结合推拉策略，减少中间物的生成，使碳通量最大程度的流向目标产物合成，由底盘菌株出发能够获得能够高产目标产物的重组菌株。
1.一种解除氮限制的代谢调控方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：在底盘菌株中增强乙酰辅酶a的通量以及异戊烯醇两步磷酸化利用途径的通量，并将底盘菌株中氮抑制型转录因子替换为组成型启动子，然后利用推拉策略增强目标产物合成的通量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰辅酶a的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中外源引入乙酰辅酶a再生途径的关键酶的编码基因；
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述异戊烯醇两步磷酸化利用途径的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中外源引入胆碱激酶ck和异戊烯磷酸激酶ipk两者的编码基因；
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氮抑制型转录因子包括转录因子area和转录因子areb，所述组成型启动子为启动子ptrpc；
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述目标产物合成的通量增强的方式采用在所述底盘菌株中过表达至少一个目标产物合成模块关键酶的编码基因；
6.一种重组菌株，其特征在于，该重组菌株由底盘菌株经权利要求1至5中任意一项所述的方法改造获得。
7.权利要求1-5中任意一项所述的方法、权利要求6所述的重组菌株在提高底盘菌株发酵生产目标产物的产量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述底盘菌株为藤仓赤霉菌，所述目标产物为赤霉酸；
9.一种生产赤霉酸的方法，其特征在于，该方法包括：按照权利要求1-5中任意一项所述的方法构建重组菌株，并将得到的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵，
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：80-100g/l葡萄糖，10-15g/l脱脂豆粕，0.05-0.2g/l mgso4·7h2o和1-2g/lkh2po4；
