本发明属于基因工程，特别涉及一种酿酒酵母的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产聚乳酸中应用。
背景技术：
1、聚乳酸(polylactic acid，pla)，又称聚丙交酯，是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，是一种新型的生物降解材料，由于其具有无毒无害特征，在一次性餐具、食品包装材料领域应用广泛；聚乳酸还具有高度安全性和可被组织吸收的特性，在医疗技术领域可应用于免拆型手术缝合线、组织修复材料、药物缓解包装剂等材料，因此，聚乳酸在可降解塑料领域具有广阔的应用前景。
2、聚乳酸的合成原料为乳酸，酿酒酵母具有对酸耐受性高、产量高的特性，成为合成聚乳酸的优良候选者。据报道，zhu等[zhu p,luo r,li y,chen x.metabolic engineeringand adaptive evolution for efficient production of l-lactic acid insaccharomyces cerevisiae.microbiol spectr.2022dec21；10(6):e0227722]对酿酒酵母乳酸代谢途径进行理性改造及适应性进化，经补料分批发酵获得121.5g/l乳酸。liu等[liut,sun l,zhang c,liu y,li j,du g,lv x,liu l.combinatorial metabolicengineering and process optimization enables highly efficient production ofl-lactic acid by acid-tolerant saccharomyces cerevisiae.bioresourtechnol.2023jul；379:129023]下调甘油和乙醇合成途径，进一步增加能量供应和氧化还原平衡，使工程菌生产192.3g/l的l-乳酸。
3、聚乳酸制备方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法工艺复杂、成本高、污染大，不利于可持续发展策略。随着合成生物学的大力发展，生物法合成聚乳酸成为一种极具潜力的策略。生物合成法主要集中在对微生物遗传工程改造以增加聚乳酸的产量，中国发明专利申请cn 114196609 a中大肠杆菌生物转化乳酸生产聚乳酸，最终发酵聚乳酸占细胞干重16％；tan等[chunlin tan,fei tao,ping xu.direct carbon capture for theproduction of high-performance biodegradable plastics by cyanobacterial cellfactories[j].green chemistry,2022,24(11):4470-4483]以蓝藻为宿主细胞，过表达pct和pha基因，聚乳酸分子量达50kda，产生36.7mg/g dcw的聚乳酸。虽然生物合成法已应用于生产聚乳酸，但产量低在一定程度上限制了微生物生产聚乳酸的广泛应用。随着合成生物学迅速发展，采用基因工程技术改造酶分子以获得高产聚乳酸的工程菌成为一个重要研究方向。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服现有技术缺陷，通过基因工程技术提高酿酒酵母工程菌株的产聚乳酸能力。
2、本发明的思路是以酿酒酵母为出发菌株，缺失酿酒酵母乙醇合成途径基因，引入聚乳酸合成基因，打通聚乳酸合成途径作为进行后续实验的基础工程菌株。另一方面，对聚乳酸合成关键基因乙酸辅酶a转移酶基因ydif进行基因挖掘，考察不同来源的ydif对重组菌的聚乳酸产能的影响，并尝试对乙酸辅酶a转移酶基因进行定点突变以期进一步提高聚乳酸的产量。
3、针对上述目的，本发明提供高产聚乳酸的重组酿酒酵母工程菌，所述重组酿酒酵母工程菌表达d-乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸辅酶a转移酶基因ydif、pha合成酶基因phac，并缺失丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh1；所述d-乳酸脱氢酶基因ldha来源于大肠杆菌(escherichia coli)，乙酸辅酶a转移酶基因ydif来源于大肠杆菌(escherichiacoli)、居泉沙雷菌(serratia fonticola)、芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)或艾伯特埃希菌(escherichia albertii)，pha合成酶基因phac来源于固褐固氮菌。
4、在本发明中，d-乳酸脱氢酶基因ldha核酸序列如seq id no.1所示；pha合成酶基因phac核酸序列如seq id no.2所示；丙酮酸脱羧酶基因pdc1核酸序列如seq id no.3所示；乙醇脱氢酶基因adh1核酸序列如seq id no.4所示；来源于大肠杆菌(escherichiacoli)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.5所示；来源于居泉沙雷菌(serratia fonticola)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.7所示；来源于芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.8所示；来源于艾伯特埃希菌(escherichia albertii)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq idno.9所示。
5、在本发明中，各表达盒是由启动子-基因-终止子构成，启动子为ptef和pgpd中一种，终止子为tadh1和tcyc1中一种。
6、特别地，本发明还提供一株高产聚乳酸的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌表达d-乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体、pha合成酶基因phac，并缺失丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh1；所述d-乳酸脱氢酶基因ldha来源于大肠杆菌(escherichia coli)，pha合成酶基因phac来源于固褐固氮菌，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体是将来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶a转移酶基因ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，或将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸，或同时将来源于居泉沙雷菌的ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸、将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸得到的。
7、在本发明中，作为重组酿酒酵母工程菌的宿主菌可以是by4741、invsc1和yph499。
8、本发明还提供乙酸辅酶a转移酶基因ydif在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成的应用，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif来源于大肠杆菌(escherichia coli)、居泉沙雷菌(serratia fonticola)、芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)或艾伯特埃希菌(escherichiaalbertii)。
9、作为一种特别优选的实施方式，本发明还提供乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成的应用，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体是将乙酸辅酶a转移酶基因ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，或将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸，或同时将ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸、将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸得到的。
10、此外，本发明还提供上述重组酿酒酵母在发酵产聚乳酸中的应用。
11、在本发明中，将高产聚乳酸的工程菌接种于50ml含sd-ura液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养72h形成种子液，将种子液按照体积比2％的接种量接种到含150ml的发酵培养基中进行200rpm、30℃好氧生长48h后，转为低供氧产酸阶段，在30℃、100rpm条件下发酵96h，得到聚乳酸。
12、另一方面，本发明还提供高产聚乳酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
13、(1)聚乳酸通路质粒构建
14、扩增大肠杆菌来源d-乳酸脱氢酶基因ldha，将扩增片段插入至py26tef-gpd的speⅰ位点，得到py26tef-l；人工合成seq id no.2所示的来源于固褐固氮菌的pha合成酶phac基因序列，扩增py26tef-gpd的gap启动子和cyc1终止子，将合成的基因片段phac基因、gap启动子和cyc1终止子插入质粒py26tef-l的ecorⅰ位点，得到质粒py26tef-lp；
15、人工合成如seq id.no.10、11、12所示的来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体ydiff199y、ydifd358l和ydiff199y-d358l基因序列，将合成的基因序列分别插入到质粒py26tef-lp的notⅰ位点，分别获得质粒py26tef-lp-ydiff199y、py26tef-lp-ydifd358l和py26tef-lp-ydiff199y-d358l；
16、(2)构建敲除pdc1和adh1基因并转入ldha基因的酿酒酵母工程菌by4741-2
17、以酿酒酵母by4841基因组为模板pcr扩增pcd1和adh1基因的上下游同源臂，所得上游同源臂片段连接到经apaⅰ和xbaⅰ酶切的ploxpura3loxp载体上，下游同源臂连接到经ndeⅰ和mluⅰ酶切的ploxpura3loxp载体上，分别得到质粒ploxpura3loxp-pdc1和ploxpura3loxp-adh1；
18、将如seq id no.13所示的cre基因合成至puc57载体上得到载体puc57-cre，以puc57-cre载体为模板扩增获得cre基因，所得基因片段连接到经hindⅲ和smaⅰ酶切的jn44-gfp载体上，得到jn44-cre载体；
19、将经apaⅰ线性化的ploxpura3loxp-pdc1转化到酿酒酵母by4741中，经sd-ura缺陷型培养基筛选出转化成功的单菌落，选取乙醇产量最低的菌株去除ura标记和jn44-cre质粒，所得菌株经pcr验证正确后命名为by4741-1，by4741-1即敲除pdc1基因的酿酒酵母by4741菌株；
20、将经apaⅰ线性化的ploxpura3loxp-adh1转入by4741-1中，经缺陷培养基和发酵筛选后去除ura标记和jn44-cre质粒，所得菌落pcr正确的菌株后命名为by4741-2，by4741-2即敲除pdc1和adh1基因的酿酒酵母by4741菌株；
21、(3)高产聚乳酸的重组酿酒酵母by4741-9、by4741-11和by4741-12的构建
22、将步骤(1)的py26tef-lp-ydiff199y、py26tef-lp-ydifd358l和py26tef-lp-ydiff199y-d358l质粒分别转到by4741-2菌株中，所得菌株涂布sd-ura平固体培养基，经扩增验证正确的菌株命名为重组酿酒酵母by4741-9、by4741-11和by4741-12。
23、本发明通过缺失丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh1，并引入d-乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸辅酶a转移酶突变体基因sfydiff199y或sfydifd358l或sfydiff199y-d358l和pha合成酶基因phac，实现以葡萄糖为原料生物合成聚乳酸。在摇瓶实验中，采用含30％葡萄糖的发酵培养基，最终最高转化获得133mg/g dcw聚乳酸。
24、与大肠杆菌和乳酸菌相比，酿酒酵母具有食品安全性、遗传背景清晰、酸环境耐受能力较强等特点，选取酿酒酵母作为宿主菌，通过基因工程手段引入乳酸合成途径有利于获得更高的乳酸产量，在本发明中，酿酒酵母乳酸产量达154g/l，为合成聚乳酸提供充足的底物。
25、本发明验证了乙酸辅酶a转移酶在酿酒酵母中具有良好的催化效果，可有效将乳酸催化为乳酰辅酶a从而进入下一步反应产生聚乳酸。本发明首次在酿酒酵母中引入聚乳酸合成通路，居泉沙雷菌来源的乙酸辅酶a转移酶基因sfydif作为通路关键基因，以乳酸为底物合成聚乳酸，获得重组酿酒酵母聚乳酸产量达87mg/g dcw。
26、本发明还通过生物信息手段对聚乳酸合成关键基因sfydif饱和诱变，实验验证筛选出sfydiff199y-d358l突变体，该突变体可使酿酒酵母聚乳酸产量达133mg/g dcw，与tan等[chunlin tan,fei tao,ping xu.direct carbon capture for the production ofhigh-performance biodegradable plastics by cyanobacterial cell factories[j].green chemistry,2022,24(11):4470-4483]相比，聚乳酸产量增加了262.39％。
1.高产聚乳酸的重组酿酒酵母工程菌，其特征在于所述重组酿酒酵母工程菌表达d-乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸辅酶a转移酶基因ydif、pha合成酶基因phac，并缺失丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh1；所述d-乳酸脱氢酶基因ldha来源于大肠杆菌(escherichia coli)，乙酸辅酶a转移酶基因ydif来源于大肠杆菌(escherichia coli)、居泉沙雷菌(serratia fonticola)、芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)或艾伯特埃希菌(escherichia albertii)，pha合成酶基因phac来源于固褐固氮菌。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于d-乳酸脱氢酶基因ldha核酸序列如seq id no.1所示；pha合成酶基因phac核酸序列如seq id no.2所示；丙酮酸脱羧酶基因pdc1核酸序列如seq id no.3所示；乙醇脱氢酶基因adh1核酸序列如seq id no.4所示；来源于大肠杆菌(escherichia coli)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.5所示；来源于居泉沙雷菌(serratia fonticola)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seqid no.7所示；来源于芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.8所示；来源于艾伯特埃希菌(escherichia albertii)的乙酸辅酶a转移酶基因的核酸序列如seq id no.9所示。
3.一株高产聚乳酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌表达d-乳酸脱氢酶基因ldha、乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体、pha合成酶基因phac，并缺失丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh1；所述d-乳酸脱氢酶基因ldha来源于大肠杆菌(escherichia coli)，pha合成酶基因phac来源于固褐固氮菌，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体是将来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶a转移酶基因ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，其核酸序列如seq id no.10所示，或将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸，其核酸序列如seq id no.11所示，或同时将来源于居泉沙雷菌的ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸、和第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸，其核酸序列如seq id no.12所示。
4.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于所述重组酿酒酵母工程菌的宿主是by4741、invsc1和yph499。
5.乙酸辅酶a转移酶基因ydif在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成的应用，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif来源于大肠杆菌(escherichia coli)、居泉沙雷菌(serratiafonticola)、芽孢杆菌(bacillus sp.oxb-1)或艾伯特埃希菌(escherichia albertii)。
6.乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体在提高酿酒酵母工程菌株的聚乳酸能成的应用，所述乙酸辅酶a转移酶基因ydif突变体是将来源于居泉沙雷菌的乙酸辅酶a转移酶基因ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸，或将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸，或同时将ydif基因的199位从苯丙氨酸突变为酪氨酸、将第358位从天冬氨酸突变为酪氨酸得到的。
7.权利要求1-4中任一项权利要求所述的重组酿酒酵母在发酵产聚乳酸中的应用。
8.一种高产聚乳酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
