本发明涉及生物技术，具体为loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断产品、方法及应用。
背景技术：
1、膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全身十大常见肿瘤之一，在我国，膀胱癌的发病率列恶性肿瘤发病率的第8位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位，膀胱癌发生于任何年龄，甚至于儿童，高发年龄为50～70岁，男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍，膀胱癌的病理类型包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌等，其中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占膀胱癌患者总数的90％以上。
2、从癌症生物学的角度来看，膀胱癌是一种复杂的疾病，其发生和发展涉及多种生物学过程，其中之一就是dna甲基化，这是一种重要的表观遗传学修饰方式，在膀胱癌的发生和发展过程中，特定的dna甲基化位点会发生变化，这些变化影响基因的表达和功能，进而促进癌症的发展，其次，从临床诊断的角度来看，早期、准确、非侵入性的诊断方法对于膀胱癌的治疗和预后至关重要。
3、数字pcr作为近些年新兴的一种检测技术，广泛应用于各研究领域，与传统检测方法相比具有以下技术优势：高灵敏度：数字pcr技术检测单分子级别的信号，对于低甲基化水平的样本也能够准确检测；高特异性：数字pcr技术采用分子标记和数字分析的方法，大大降低假阳性结果的出现；准确定量：数字pcr技术对甲基化水平进行准确定量，为临床医生提供更多关于疾病进程和疗效评估的信息。
4、但是，传统的膀胱癌检测存在以下缺点：
5、(1)目前检测和监测膀胱癌的方法往往具有一定的侵入性，如组织活检，或者敏感性和特异性较差，尤其是在早期、微小和残留的肿瘤检测中；
6、(2)目前，膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜检查、组织活检和尿液细胞学检查等，然而，这些方法具有一定的局限性，可能给患者带来不适或者并发症，且敏感性和特异性也存在一定的局限性，传统的甲基化检测方法如msp虽然可以检测到甲基化基因的存在，但对于低甲基化水平的样本往往灵敏度不足，容易造成漏检，而且操作繁琐，需进行多个步骤的操作，包括dna提取、亚硫酸盐转化、pcr扩增和电泳等，而且传统检测方法无法对甲基化水平进行准确定量，无法为临床医生提供更多关于疾病进程和疗效评估的信息。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断产品、方法及应用，以解决上述背景技术中提出的目前检测和监测膀胱癌的方法往往具有一定的侵入性，如组织活检，或者敏感性和特异性较差，尤其是在早期、微小和残留的肿瘤检测中；目前，膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜检查、组织活检和尿液细胞学检查等，然而，这些方法具有一定的局限性，可能给患者带来不适或者并发症，且敏感性和特异性也存在一定的局限性，传统的甲基化检测方法如msp虽然可以检测到甲基化基因的存在，但对于低甲基化水平的样本往往灵敏度不足，容易造成漏检，而且操作繁琐，需进行多个步骤的操作，包括dna提取、亚硫酸盐转化、pcr扩增和电泳等，而且传统检测方法无法对甲基化水平进行准确定量，无法为临床医生提供更多关于疾病进程和疗效评估的信息的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断产品，包括产品本体，所述产品本体包括上游甲基化引物f、下游甲基化引物r、甲基化探针p、内参上游引物f、内参下游引物r和内参探针p。
3、本发明loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，包括以下步骤：
4、步骤一、甲基化引物探针的设计：通过前期杂交捕获测序，经过多重数据过滤分析，筛选出3个膀胱癌高甲基化靶标loc100462988、stac和efcab6，针对筛选出的3个高甲基化基因上的多个甲基化位点设计特异性的甲基化检测引物探针，同时针对内参基因actb设计检测引物探针，其中，甲基化探针和内参探针序列的5’端标记有荧光标记集团，3’端标记有相应的荧光淬灭集团；
5、步骤二、样本收集：收集的样本包含健康人来源尿液样本、膀胱癌尿液样本、阳性标准品人基因组甲基化标准品和空白对照；
6、步骤三、dna的提取：提取尿液dna备用并进行亚硫酸氢盐转化；
7、步骤四、甲基化数字pcr扩增体系建立：利用步骤三中提取的dna检测和定量靶序列；
8、步骤五、检测结果判读：经过步骤四中反应后对应用结果进行判读，通过仪器自带的分析软件对各样本的扩增结果进行分析。
9、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤一中杂交捕获测序流程如下：s1、文库构建：使用acegen_human methylome_2m_panel_cgi_hg38.bed的panel进行甲基化液相捕获建库，对基因组样本进行质检，合格后进行甲基化液相捕获建库测序；s2、上机测序：库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illuminahiseq测序；s3、生信分析：获得原始测序序列后，进行生物信息分析。
10、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤一中荧光集团为fam、hex、cy5和rox，所述步骤一中荧光淬灭集团为bhq1、bhq2和bhq3。
11、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中dna的提取具体流程为：s1、取样：使用50人份的mini kit时，按标签所述将1.2ml protease solvent加入至protease小管中，震荡混匀；使用250人份的mini kit时，按标签所述将5.5ml protease solvent加入至protease小管中，震荡混匀，溶解后的蛋白酶k溶液(protease)保存在4℃；s2、试剂准备：buffer al使用前需震荡混匀，buffer aw1与buffer aw2使用前需按标签提示加入无水乙醇；
12、s3、样本处理：将尿液样本进行4200rpm离心5min，弃上清；加10ml 0.25×pbs重悬沉淀，4200rpm，离心5min，弃上清；再次使用500μl 0.25×pbs重悬沉淀，将重悬液移入新的1.5ml离心管中，4200rpm，离心5min；弃上清，加入200μl 0.25×pbs，用移液器吹打重悬沉淀；s4、样品补足：在1.5ml离心管中加入20μl的蛋白酶k溶液(protease)，全部的200μl的重悬液和200μl的buffer al，涡旋混匀15s，(蛋白酶k和buffer al不要同时加入，以免损伤蛋白酶k活性；当样本重悬液不足200μl时，用pbs补足至200μl；s5、孵育：金属浴中56℃孵育10min；s6、第一次离心：孵育完成后，短暂离心；加入200μl的无水乙醇，涡旋混匀15s，短暂离心；s7、第二次离心：将配套的离心柱套上2ml离心管中，将s3中的混合液全部转移至离心柱中，6000g，离心1min，丢弃滤液及离心管；s8、第三次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，加入500μl的buffer aw1，6000g离心1min，弃滤液及离心管；s9、第四次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，加入500μl的buffer aw2，20000g离心3min，弃滤液及离心管；s10、第五次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，20000g离心1min，弃滤液及离心管；s11、核酸收集：将离心柱转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl的buffer ae，室温孵育5min，随后6000g离心1min，收集液即为总核酸。
13、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤三中亚硫酸氢盐转化具体为s1、实验前准备：准备好脱硫纯化所用磁珠(按照体积比配制m-binding buffer：magbinding beads＝60：1，magbingding容易沉淀，要充分混匀)、80％乙醇和m-elution buffer(te)s2、pcr反应：向16ul待bs处理的dna样本中加入104ul lightining conversion reagent(避光保存，记录好开瓶日期)，充分混匀后，在pcr仪上进行反应，反应体积为20ul，反应条件为热盖105℃，98℃，8min；54℃，60min；4℃，保持不超过20；s3、结合：加入488ul(m-binding buffer+magbinding beads)磁珠轻轻吸打混匀，静置5min，后放置在磁力架上2-5min，至溶液完全澄清；s4、第一次洗涤：用移液枪将上清缓缓吸弃，枪头避免扰动磁珠，加入200ul新配的80％乙醇，轻轻洗涤磁珠，静置30s后弃上清；s5、脱硫：加入160ul l-desulphonationbuffer，充分吸打混匀，室温静置15min，放置在磁力架上磁吸3min，至溶液澄清透亮，此步骤总时长不超过25min；s6、第二次洗涤：用移液枪将上清缓缓吸弃，枪头避免扰动磁珠，加入200ul新配的80％乙醇，轻轻洗涤磁珠，静置30s后弃上清，洗涤两次；s7、晾干：放置于磁力架上室温静置1-5min晾干磁珠，待酒精完全挥发，管壁上无明显液滴，且磁珠哑光不开裂状态；s8、洗脱：从磁力架上取下，加入80ul te，吸打混匀后静置3-5min，磁力架上吸附1-3min，至溶液澄清透亮后将dna溶液吸入新的离心管中。
14、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中甲基化数字pcr扩增体系建立具体流程为：s1、数字pcr反应液的制备：引物终浓度为400nm，探针终浓度为200nm，将反应液i、反应液ii、efcab6-f(100μm)、efcab6-r(100μm)、efcab6-p(100μm)、stac-f(100μm)、stac-r(100μm)、stac-p(100μm)、loc100462988-f(100μm)、loc100462988-r(100μm)、loc100462988-p(100μm)、actb-f(100μm)、actb-r(100μm)、actb-p(100μm)和ddh2o按体积配置反应液，每次配置的量为n+3，n为待测样本数；s2、混合装管：配好混匀离心后使用八连管分装，15μl/管；s3、加样：每管加入5μl对应的bis dna；s4、投放样品池：按照芯片说明书，将准备好的待测反应液加入芯片的样本池；s5、检测反应：将加样完成的芯片放入仪器，并在软件上进行检测，具体为ung处理、预变性、退火和延伸。
15、作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤五中单次实验各组扩增结果应满足如下要求，每个样本生成的液滴总数应大于15000；空白对照(ntc)各个荧光通道都无阳性液滴，甲基化标准品各甲基化位点跟内参均有阳性液滴，样本检测结果判读：样本生成的液滴总数大于15000，3个甲基化靶标有两个以上检测阳性时，判定该样本检测结果为阳性，否则为阴性。
16、本发明loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断应用，其特征在于：对尿液样本进行dna提取与亚硫酸氢盐转化，然后进行数字pcr检测loc100462988、stac和efcab6的甲基化水平，并对各组扩增的结果进行分析。
17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18、1、真正实现无创检测，应用数字pcr技术检测膀胱癌多基因甲基化的试剂盒通过检测人体尿液中相关基因的甲基化程度来辅助膀胱癌诊断，实现无创检测。
19、2、单管实现多重检测，在一个反应管中进行3个甲基化靶标的检测，很大程度上避免了漏诊跟误诊。
20、3、检测灵敏度高，本试剂盒准确检测出浓度低于5拷贝的样本，且重复性好。
21、4、准确定量甲基化水平，相比qpcr对甲基化的相对检测，数字pcr实现对甲基化水平的准确定量，为临床医生提供更多关于疾病进程和疗效评估的信息。
22、5、操作简单方便，本试剂盒配套的数字pcr仪器为一体机，只需将配置好的反应液和芯片放入仪器中，仪器自动进行液滴生成，pcr扩增和荧光检测，极大的减少了人为操作带来的误差。
1.loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断产品，包括产品本体，其特征在于：所述产品本体包括上游甲基化引物f、下游甲基化引物r、甲基化探针p、内参上游引物f、内参下游引物r和内参探针p。
2.根据权利要求1所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤一中杂交捕获测序流程如下：s1、文库构建：使用acegen_human methylome_2m_panel_cgi_hg38.bed的panel进行甲基化液相捕获建库，对基因组样本进行质检，合格后进行甲基化液相捕获建库测序；s2、上机测序：库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行illumina hiseq测序；s3、生信分析：获得原始测序序列后，进行生物信息分析。
4.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤一中荧光集团为fam、hex、cy5和rox，所述步骤一中荧光淬灭集团为bhq1、bhq2和bhq3。
5.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤三中dna的提取具体流程为：s1、取样：使用50人份的minikit时，按标签所述将1.2ml protease solvent加入至protease小管中，震荡混匀；使用250人份的minikit时，按标签所述将5.5ml protease solvent加入至protease小管中，震荡混匀，溶解后的蛋白酶k溶液(protease)保存在4℃；s2、试剂准备：buffer al使用前需震荡混匀，buffer aw1与buffer aw2使用前需按标签提示加入无水乙醇；s3、样本处理：将尿液样本进行4200rpm离心5min，弃上清；加10ml 0.25×pbs重悬沉淀，4200rpm，离心5min，弃上清；再次使用500μl0.25×pbs重悬沉淀，将重悬液移入新的1.5ml离心管中，4200rpm，离心5min；弃上清，加入200μl 0.25×pbs，用移液器吹打重悬沉淀；s4、样品补足：在1.5ml离心管中加入20μl的蛋白酶k溶液(protease)，全部的200μl的重悬液和200μl的buffer al，涡旋混匀15s，(蛋白酶k和buffer al不要同时加入，以免损伤蛋白酶k活性；当样本重悬液不足200μl时，用pbs补足至200μl；s5、孵育：金属浴中56℃孵育10min；s6、第一次离心：孵育完成后，短暂离心；加入200μl的无水乙醇，涡旋混匀15s，短暂离心；s7、第二次离心：将配套的离心柱套上2ml离心管中，将s3中的混合液全部转移至离心柱中，6000g，离心1min，丢弃滤液及离心管；s8、第三次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，加入500μl的buffer aw1，6000g离心1min，弃滤液及离心管；s9、第四次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，加入500μl的bufferaw2，20000g离心3min，弃滤液及离心管；s10、第五次离心：将离心柱转移至新的2ml离心管中，20000g离心1min，弃滤液及离心管；s11、核酸收集：将离心柱转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl的buffer ae，室温孵育5min，随后6000g离心1min，收集液即为总核酸。
6.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤三中亚硫酸氢盐转化具体为s1、实验前准备：准备好脱硫纯化所用磁珠(按照体积比配制m-binding buffer：magbinding beads＝60：1，magbingding容易沉淀，要充分混匀)、80％乙醇和m-elution buffer(te)s2、pcr反应：向16ul待bs处理的dna样本中加入104ul lightining conversion reagent(避光保存，记录好开瓶日期)，充分混匀后，在pcr仪上进行反应，反应体积为20ul，反应条件为热盖105℃，98℃，8min；54℃，60min；4℃，保持不超过20；s3、结合：加入488ul(m-binding buffer+magbinding beads)磁珠轻轻吸打混匀，静置5min，后放置在磁力架上2-5min，至溶液完全澄清；s4、第一次洗涤：用移液枪将上清缓缓吸弃，枪头避免扰动磁珠，加入200ul新配的80％乙醇，轻轻洗涤磁珠，静置30s后弃上清；s5、脱硫：加入160ul l-desulphonation buffer，充分吸打混匀，室温静置15min，放置在磁力架上磁吸3min，至溶液澄清透亮，此步骤总时长不超过25min；s6、第二次洗涤：用移液枪将上清缓缓吸弃，枪头避免扰动磁珠，加入200ul新配的80％乙醇，轻轻洗涤磁珠，静置30s后弃上清，洗涤两次；s7、晾干：放置于磁力架上室温静置1-5min晾干磁珠，待酒精完全挥发，管壁上无明显液滴，且磁珠哑光不开裂状态；s8、洗脱：从磁力架上取下，加入80ulte，吸打混匀后静置3-5min，磁力架上吸附1-3min，至溶液澄清透亮后将dna溶液吸入新的离心管中。
7.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤四中甲基化数字pcr扩增体系建立具体流程为：s1、数字pcr反应液的制备：引物终浓度为400nm，探针终浓度为200nm，将反应液i、反应液ii、efcab6-f(100μm)、efcab6-r(100μm)、efcab6-p(100μm)、stac-f(100μm)、stac-r(100μm)、stac-p(100μm)、loc100462988-f(100μm)、loc100462988-r(100μm)、loc100462988-p(100μm)、actb-f(100μm)、actb-r(100μm)、actb-p(100μm)和ddh2o按体积配置反应液，每次配置的量为n+3，n为待测样本数；s2、混合装管：配好混匀离心后使用八连管分装，15μl/管；s3、加样：每管加入5μl对应的bis dna；s4、投放样品池：按照芯片说明书，将准备好的待测反应液加入芯片的样本池；s5、检测反应：将加样完成的芯片放入仪器，并在软件上进行检测，具体为ung处理、预变性、退火和延伸。
8.根据权利要求2所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断方法，其特征在于：所述步骤五中单次实验各组扩增结果应满足如下要求，每个样本生成的液滴总数应大于15000；空白对照(ntc)各个荧光通道都无阳性液滴，甲基化标准品各甲基化位点跟内参均有阳性液滴，样本检测结果判读：样本生成的液滴总数大于15000，3个甲基化靶标有两个以上检测阳性时，判定该样本检测结果为阳性，否则为阴性。
9.根据权利要求1所述的loc100462988、stac、efcab6标志物的诊断应用，其特征在于：对尿液样本进行dna提取与亚硫酸氢盐转化，然后进行数字pcr检测loc100462988、stac和efcab6的甲基化水平，并对各组扩增的结果进行分析。
