本发明属于分析测试，尤其涉及一种液相色谱法对5-羟甲基糠醛在注射用甲磺酸加贝酯配伍试验中含量的测定方法。
背景技术：
1、注射用甲磺酸加贝酯为非多肽类蛋白抑制剂，并能抑制胰蛋白酶和激肽释放酶的活性。此外，还可抑制纤维素溶酶，这些活性酶被激活后，易引起某些疾病，如急性胰腺炎，经甲磺酸加贝酯注射后，可减轻症状，也可改善水肿性胰腺炎，对急性出血坏死性胰腺炎有辅助治疗作用。
2、本品仅供静脉滴注使用，每次100mg，治疗开始头3天每日用量300mg，症状减轻后改为100mg/日。疗程6-10天。先以5ml注射用水注入盛有加贝酯冻干粉针瓶内，待溶解后即移注于500ml的5％葡萄糖溶液或林格氏液中，供静脉滴注用。
3、5-羟甲基糠醛是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一种具有呋喃环结构的糠醛化合物，是一种具有潜在安全隐患的药品内源性污染物。2020版《中国药典》对葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛检测规定：精密量取本品适量(约相当于葡萄糖1.0g)，置100量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在284nm的波长处测定，吸光度不得大于0.32。2020年版《中国药典》肌酐葡萄糖注射液、阿昔洛韦葡萄糖注射液质量标准中收载了对5-羟甲基糠醛进行控制的高效液相方法，限度为0.02％和0.03％。
4、在配伍试验中，单纯用紫外分光光度法测定5-羟甲基糠醛，会有甲磺酸加贝酯以及相关杂质的干扰，因而不能用紫外分光光度法。而肌酐葡萄糖注射液、阿昔洛韦葡萄糖注射液质量标准中收载的对5-羟甲基糠醛进行控制的方法是对特有品种所适用。综上所述，我们需要一种分析方法，可以使5-羟甲基糠醛与甲磺酸加贝酯以及相关杂质有效分离，能够高效测定5-羟甲基糠醛含量。
5、
技术实现思路
1、本发明提供了一种测定5-羟甲基糠醛的方法，进而还提供了将5-羟甲基糠醛与甲磺酸加贝酯的降解杂质对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸同时进行含量检测的方法，本方法能快速、准确、方便的检测三种成分的含量，而且能与主成分甲磺酸加贝酯有效分离，具有良好的专属性和系统精密度。
2、本发明采用如下技术方案：
3、发明提供了一种5-羟甲基糠醛的测定方法，所述方法是利用高效液相色谱法，其特征在于所述高效液相色谱的检测波长为284nm，色谱柱为c18柱，流动相为醋酸水溶液和甲醇。
4、优选地，上述所述的测定方法，其中所述的流动相为(0.5n1.5)％的醋酸水溶液和甲醇。
5、优选地，上述所述的测定方法，其中所述流动相为1％醋酸水溶液和甲醇的比例为48：52。
6、优选地，上述所述的测定方法，其中所述高效液相色谱的柱温为20-30℃，进样量为10-50μl，流动相流速为0.9-1.1ml/min。
7、本发明还提供了上述所述的测定方法用于测定甲磺酸加贝酯输液剂中有关物质的应用。
8、上述所述的应用，其中所述的甲磺酸加贝酯输液剂为注射用甲磺酸加贝酯葡萄糖溶液。例如，注射用甲磺酸加贝酯冻干粉针，先以5ml注射用水注入冻干粉针瓶内，待溶解后即移注于500ml的5％葡萄糖溶液中，供静脉滴注用。
9、本发明还提供了一种甲磺酸加贝酯输液剂中有关物质的测定方法，所述的甲磺酸加贝酯输液剂为注射用甲磺酸加贝酯葡萄糖溶液，所述方法是利用高效液相色谱法，其特征在于所述高效液相色谱的检测波长为284nm(测定5-羟甲基糠醛)和258nm(测定对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸)，色谱柱为c18柱，流动相为醋酸水溶液和甲醇。
10、优选地，上述所述的测定方法，其中所述的流动相为(0.5n1.5)％的醋酸水溶液和甲醇。
11、优选地，上述所述的测定方法，其中所述流动相为1％醋酸水溶液和甲醇的比例为48：52。
12、优选地，上述所述的测定方法，其中所述高效液相色谱的柱温为20-30℃，进样量为10-50μl，流动相流速为0.9-1.1ml/min。
13、作为本发明具体实施方式之一，本发明所述的高效液相色谱法测定的色谱条件为：
14、检测器：dad(光电二级阵列管)检测器，检测波长为284nm(测定5-羟甲基糠醛)和258nm(测定对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸)；
15、色谱柱：c18柱；
16、柱温：20-30℃；
17、进样量：10-50μl；
18、流动相：醋酸水溶液和甲醇；
19、流动相流速：0.9-1.1ml/min。
20、更优选地，上述所述的方法，其中所述色谱柱为kromasil 100-5-c18(4.6×250mm，5μm)。
21、更优选地，上述所述的方法，其中所述柱温为25℃。
22、更优选地，上述所述的方法，其中所述流动相为0.5％n1.5％的醋酸水溶液和甲醇；
23、更优选地，上述所述的方法，其中所述流动相为1％醋酸水溶液和甲醇的比例为48：52
24、本发明提供的分析或测定方法，能够将5-羟甲基糠醛，对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸同时进行含量检测，而且与主成分甲磺酸加贝酯有效分离，显示出了在注射用甲磺酸加贝酯配伍试验中的分析方法的专属性好，高效便捷，大大缩短了分析时间。
25、本发明还对所述方法进行了方法学验证。
26、液相色谱测试的条件为：
27、色谱柱为agela venusil asb c18，5μm，4.6*250mm；柱温为25℃；进样体积为50μl；流动相为1％醋酸水溶液和甲醇(48：52)；流动相流速为1.0ml/min；检测器为dad(光电二级阵列管)检测器；检测波长为284nm(测定5-羟甲基糠醛)和258nm(测定对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸)。
28、(1)专属性
29、供试品溶液制备：精密称取甲磺酸加贝酯10mg，置50ml容量瓶中，加甲烷磺酸甲醇溶解并定容至刻度，即得。
30、标准品定位溶液制备：分别称取5-羟甲基糠醛，对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸标准品适量，加甲烷磺酸甲醇溶解分别配制成浓度为10μg/ml，50μg/ml和20μg/ml的溶液，作为标准品定位溶液。
31、混合溶液：分别称取甲磺酸加贝酯、5-羟甲基糠醛、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸标准品适量，加甲烷磺酸甲醇溶解配制成浓度分别为0.2mg/ml、10μg/ml，50μg/ml和20μg/ml的混合溶液。
32、取上述制备溶液进样分析。空白溶剂不干扰杂质检测；如有干扰应低于检测限。结果显示，5-羟甲基糠醛与甲磺酸加贝酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸分离度好，本分析方法专属性良好(表1)。
33、表1注射用甲磺酸加贝酯配伍溶液中5-羟甲基糠醛专属性结果
34、
35、(2)线性与范围
36、对照品储备液的配制：精密称取5-羟甲基糠醛10mg，置100ml容量瓶中，用甲烷磺酸甲醇溶解并定溶至刻度，摇匀即得；
37、按表2配制线性系列溶液。线性系列溶液中各浓度为限度浓度的5％，25％，50％，100％，150％，250％，500％。
38、表25-羟甲基糠醛线性范围溶液的配制
39、 样品名称 cl-aai对照品储备液体积(ml) 定容体积(ml) cal.-1(5％) 0.1ml 20 cal.-2(25％) 1 40 cal.-3(50％) 1 20 cal.-4(100％) 1 10 cal.-5(150％) 1.5 10 ca1.-6(250％) 5 20 cal.-7(500％) 5 10
40、分别取上述溶液进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性曲线，5-羟甲基糠醛线性试验结果见表3，回归曲线如图1所示，线性回归曲线方程为：y＝75.187x+8.5847，5-羟甲基糠醛线性相关系数r2＝0.9997。
41、表35-羟甲基糠醛线性试验结果
42、 样品名称 浓度(μg/ml) 峰面积 cal.-1(5％) 0.4557 34.18 cal.-2(25％) 2.2783 170.53 cal.-3(50％) 4.5565 342.72 cal.-4(100％) 9.1130 685.63 cal.-5(150％) 13.6695 1085.21 cal.-6(250％) 22.7825 1716.28 cal.-7(500％) 45.5650 3425.46
43、(3)检测限和定量限(loq)
44、以各组分定量离子信噪比约为3：1时对应浓度为检测限，信噪比约为10：1时为定量限，检测限和定量限结果如表4所示。
45、表45-羟甲基糖醛检测限与定量限
46、
47、
48、结论：本方法的检测灵敏度良好。
49、(4)分析方法耐用性
50、改变柱温(25±5℃)，改变流速(1.0±0.1ml/min)，考察配伍溶液中，5-羟甲基糠醛与对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸和甲磺酸加贝酯的分离情况。结果表明，该分析方法耐用性良好，5-羟甲基糠醛仍旧可以被有效检测，与对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸和甲磺酸加贝酯能够分离，如表5所示：
51、表55-羟甲基糠醛分析方法耐用性
52、
1.一种5-羟甲基糠醛的测定方法，所述方法是利用高效液相色谱法，其特征在于所述高效液相色谱的检测波长为284nm，色谱柱为c18柱，流动相为醋酸水溶液和甲醇。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述的流动相为(0.5～1.5)％的醋酸水溶液和甲醇。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其中所述流动相为1％醋酸水溶液和甲醇的比例为48:52。
4.根据权利要求1-3所述的测定方法，其中所述高效液相色谱的柱温为20-30℃，进样量为10-50μl，流动相流速为0.9-1.1ml/min。
5.权利要求1-4所述的测定方法用于测定甲磺酸加贝酯输液剂中有关物质的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述的甲磺酸加贝酯输液剂为注射用甲磺酸加贝酯葡萄糖溶液。
7.一种甲磺酸加贝酯输液剂中有关物质的测定方法，所述的甲磺酸加贝酯输液剂为注射用甲磺酸加贝酯葡萄糖溶液，所述方法是利用高效液相色谱法，其特征在于所述高效液相色谱的检测波长为284nm和258nm，色谱柱为c18柱，流动相为醋酸水溶液和甲醇。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其中所述的流动相为(0.5～1.5)％的醋酸水溶液和甲醇。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其中所述流动相为1％醋酸水溶液和甲醇的比例为48:52。
10.根据权利要求7-9所述的测定方法，其中所述高效液相色谱的柱温为20-30℃，进样量为10-50μl，流动相流速为0.9-1.1ml/min。
