本发明涉及生物，具体地，本发明涉及果蝇高效转录抑制系统，更具体地，本发明涉及一种构建果蝇转录抑制系统的方法、制备转基因果蝇的方法和抑制果蝇基因表达的方法。
背景技术：
1、果蝇(学名：drosophila melanogaster)是一种小型两翅目昆虫，广泛应用于生物学研究中的模式生物之一。果蝇作为模式生物具有以下优势：个体体积小、易于培养和繁殖、相对较低的成本、简单的生命周期；结果可适用于人类；多细胞生物；具有多种便利高效的转基因技术。个体体积小是指果蝇个体相对较小，长约3mm；易于培养和繁殖是指果蝇可以在相对简单的实验条件下进行培养，只需要一些简单的培养基和适当的温度，它们繁殖迅速，每个成年果蝇每天可以产卵数十个，从而提供了大量的实验材料；相对较低的成本是指相比于其他模式生物(如小鼠)，果蝇的养殖和实验成本相对较低，这使得果蝇成为许多实验室的首选模式生物之一。简单的生命周期是指果蝇的生命周期相对短暂，从卵到成虫仅需约10天，因此，可以在短时间内观察到多代果蝇，从而迅速进行基因遗传和发育的研究。结果可适用于人类是指果蝇的实验结果可转移到人类，因为果蝇80％的基因与人类同源，60％以上的人类疾病基因可以在果蝇身上找到。多细胞生物是指可以利用遗传学的方法来研究介导细胞与细胞、组织与组织相互作用的信号通路。具有多种便利高效的转基因技术，包括靶向激活剂、转基因rnai和基因组编辑技术，从而能够在空间和时间上研究基因。
2、调控目的基因的表达是目前最为常见的技术手段，主要通过增强基因功能和降低基因功能实现。在果蝇中，增强基因表达的技术手段主要通过过表达、转录激活进行，降低基因表达的技术手段主要包括转基因干扰技术和转录抑制技术。然而，将现有的转录抑制系统应用于果蝇时，调控基因表达效率有限。因此，针对果蝇基因的转录抑制系统还需要进一步改进。
技术实现思路
1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、发明人发现，现有的果蝇转录抑制系统抑制基因表达的效率较低。为了克服这一问题，发明人筛选到合适的转录抑制因子与dcas9结合，进而构建果蝇高效转录抑制系统，抑制果蝇中的基因表达。
3、基于此，本发明的第一个方面，本发明提出了一种转录抑制系统。根据本发明的实施例，所述转录抑制系统包括：dcas9蛋白表达元件和sgrna表达元件；其中，所述dcas9蛋白表达元件中包括dcas9蛋白编码框和转录抑制因子编码框；所述sgrna表达元件包括sgrna编码框，所述转录抑制系统为适于在果蝇中表达的载体。本发明提供的转录抑制系统通过连接合适的转录抑制因子pgc，加上合适的表达载体支架，尤其是使用了p10作为poly-a，使得dcas9蛋白表达元件的表达量更高，从而提高转录抑制系统的抑制效率。利用本发明提供的转录抑制系统，尤其可以将其应用于果蝇中基因的转录抑制，毒性低、操作简单，抑制基因表达的效率高，便于进行大规模高通量的操作。
4、本发明的第二个方面，本发明提出了一种转录抑制系统。根据本发明的实施例，所述转录抑制系统包括：dcas9蛋白表达元件、sgrna表达元件、定点整合基因元件和筛选标记基因元件；
5、其中，所述dcas9蛋白表达元件依照5'端到3'端的方向，依次为10xuas、dscp启动子、dcas9蛋白编码框、mcp融合蛋白编码框、ftz内含子和poly-a p10，所述10xuas、dscp启动子、dcas9蛋白编码框、第二gs linke编码框、第二nls编码框、t2a编码框、mcp融合蛋白编码框、第一gs linke编码框、第一nls编码框、pgc基因编码框、ftz内含子和poly-a p10可操作性地相连；
6、所述sgrna表达元件依照5'端到3'端的方向，依次为u6b启动子、多克隆酶切位点、sgrna核心编码框、u6b 3'非翻译区；
7、所述dcas9蛋白表达元件的5'端上游包含gypcy绝缘子；所述sgrna表达元件的5'端上游包含gypcy绝缘子；
8、所述定点整合基因元件为attb基因；
9、所述筛选标记基因元件为氨苄青霉素抗性基因、vermilion；所述转录抑制系统用于果蝇中基因的转录抑制。本发明提供的转录抑制系统通过连接合适的转录抑制因子pgc，加上合适的表达载体支架，尤其是使用了p10作为poly-a，使得dcas9蛋白表达元件的表达量更高，从而提高转录抑制系统的抑制效率。利用本发明提供的转录抑制系统，尤其可以将其应用于果蝇中基因的转录抑制，毒性低、操作简单，抑制基因表达的效率高，便于进行大规模高通量的操作。
10、本发明的第三个方面，本发明提出了一种构建前述的转录抑制系统的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
11、(1)改造质粒载体，构建包含有dcas9蛋白编码框及sgrna编码框的第一重组质粒，其中，所述质粒载体包括flysam质粒；
12、(2)将所述dcas9蛋白编码框中的poly-a sv40替换为poly-a p10，得到第二重组质粒；
13、(3)将转录抑制因子编码框连接到所述第二重组质粒上，构建得到第三重组质粒，其中所述转录抑制因子编码框位于所述dcas9蛋白编码框的下游。本发明提供的转录抑制系统通过连接合适的转录抑制因子pgc，加上合适的表达载体支架，尤其是使用了p10作为poly-a，使得dcas9蛋白表达元件的表达量更高，从而提高转录抑制系统的抑制效率。利用本发明提供的转录抑制系统，尤其可以将其应用于果蝇中基因的转录抑制，毒性低、操作简单，抑制基因表达的效率高，便于进行大规模高通量的操作。
14、本发明的第四个方面，本发明提出了一种制备转基因果蝇的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将靶向目的基因的如本发明第一方面或者本发明第二方面所述的转录抑制系统显微注射到果蝇胚胎中，所述转录抑制系统中的sgrna编码框表达的sgrna能够靶向所述目的基因，获得转基因果蝇。根据本发明实施例的方法能够制备目的基因被抑制的转基因果蝇。
15、本发明的第五个方面，本发明提出了一种抑制果蝇基因表达的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将靶向目标基因的sgrna序列导入到本发明第一方面或者本发明第二方面所述的转录抑制系统，获得靶向目标基因的转录抑制系统；
16、将所述靶向目标基因的转录抑制系统显微注射到果蝇胚胎中，后续通过筛选眼色获得转基因果蝇；
17、将所述转基因果蝇与gal4工具果蝇杂交培养，获得果蝇后代，从而抑制后代果蝇中目标基因的表达。根据本发明实施例的方法能够抑制转基因果蝇中的目的基因的表达。
18、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
1.一种转录抑制系统，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的转录抑制系统，其特征在于，所述转录抑制因子包括pgc；
3.根据权利要求1所述的转录抑制系统，其特征在于，所述转录抑制因子编码框设置于融合蛋白编码框中，所述融合蛋白编码框包括所述转录抑制因子编码框和基因锚定蛋白编码框。
4.根据权利要求3所述的转录抑制系统，其特征在于，所述基因锚定蛋白编码框包括mcp蛋白编码框。
5.根据权利要求3所述的转录抑制系统，其特征在于，所述sgrna表达元件进一步包括基因锚定蛋白识别序列，所述基因锚定蛋白识别序列转录产物适于与所述sgrna形成复合物，且所述基因锚定蛋白识别序列转录产物适于与所述基因锚定蛋白结合。
6.根据权利要求3所述的转录抑制系统，其特征在于，所述dcas9蛋白表达元件依照5'端到3'端的方向，依次包括10xuas序列、第一启动子、dcas9蛋白编码框、融合蛋白编码框、载体转录增强因子和poly-a，所述第一启动子、dcas9蛋白编码框、融合蛋白编码框、载体转录增强因子和poly-a可操作性地相连；
7.根据权利要求5所述的转录抑制系统，其特征在于，所述sgrna表达元件依照5'端到3'端的方向，依次包括第二启动子、多克隆酶切位点、sgrna核心编码框、第二启动子3'非翻译区序列，所述第二启动子、多克隆酶切位点、sgrna核心编码框、第二启动子3'非翻译区序列可操作性地相连；
8.根据权利要求1～7任一项所述的转录抑制系统，其特征在于，所述转录抑制系统进一步包括定点整合基因元件和筛选标记基因元件；
9.一种转录抑制系统，其特征在于，所述转录抑制系统包括：
10.一种构建权利要求1～9中任一项所述的转录抑制系统的方法，其特征在于，包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述改造质粒载体是通过如下方式进行的：去除所述质粒载体中的转录激活结构域vp64、p65和hsf1，得到包含有dcas9蛋白编码框及sgrna编码框的第一重组质粒。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)中通过酶切连接或同源重组的方式将p10连接到所述第一重组质粒上；
13.一种制备转基因果蝇的方法，其特征在于，包括：将靶向目的基因的如权利要求1～8任一项或者如权利要求9所述的转录抑制系统显微注射到果蝇胚胎中，所述转录抑制系统中的sgrna编码框表达的sgrna能够靶向所述目的基因，获得转基因果蝇。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述转录抑制系统是通过如下方式获得的：
15.一种抑制果蝇基因表达的方法，其特征在于，包括：将靶向目标基因的sgrna序列导入到权利要求1～8任一项所述的转录抑制系统或者权利要求9所述的转录抑制系统，获得靶向目标基因的转录抑制系统；
