本发明涉及结肠直肠癌(co l orecta l cancer，crc)体外诊断领域，具体涉及一种基于粪便样本的结直肠癌筛查方法。
背景技术：
1、随着全球人口老龄化和生活方式变化，结直肠癌(co l orecta l cancer,crc)的发病率和死亡率不断上升，成为全球范围内健康的一大威胁。统计数据显示，结直肠癌是全球第三常见的癌症类型，并且是导致癌症相关死亡的第四大原因。
2、结直肠癌的早期症状往往不明显，患者可能会忽视其重要性，导致大多数患者在确诊时癌症已处于中晚期，治疗效果和预后相对较差。因此，早期筛查和诊断对于提高结直肠癌患者的生存率至关重要。早期发现结直肠癌及其前期病变(如腺瘤)可以显著降低死亡风险，并且治疗相对简单，费用较低。
3、目前，结直肠癌的筛查方法包括粪便潜血试验、柔性乙状结肠镜检查、双对比钡剂灌肠以及结肠镜检查。粪便潜血试验是一种无创筛查手段，但其敏感性和特异性不足；结肠镜检查虽然是金标准，但具有较强的侵入性、准备程序复杂且对患者来说可能产生不适和并发症。
4、随着对人体微生物群及其在疾病中作用的深入研究，研究者发现结直肠癌患者的肠道微生物组成存在特定的变化，这些变化可能与肿瘤的发生发展有关。因此，粪便中的微生物组成及其遗传物质变化成为可能的早期诊断标志物。
5、此外，粪便中的其他分子标志物，如dna甲基化模式、特定的蛋白表达模式或代谢物变化，也被证明与结直肠癌的发生发展关联。因此，通过粪便样本分析这些生物标志物，可以提供一种非侵入性、高敏感性和高特异性的筛查方法。
6、尽管有一些基于粪便的检测产品已经进入市场，但仍存在敏感度和特异性不足、无法检测前期病变、结果解释困难等问题。因此，开发一种基于粪便样本检测并综合利用肠道微生物组和分子生物标志物的结直肠癌筛查方法，以实现结直肠癌的高效、准确筛查，是当前临床和科研领域的重要任务之一。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提出了一种基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，该方法结合了微生物组序列分析和特定生物标志物的检测，旨在实现对结直肠癌的高效、准确筛查。
2、本发明采用以下技术方案实现：
3、第一方面，本发明提供了一种基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，该方法包括以下步骤：
4、获取专用的粪便样本收集器收集的粪便样本，并通过物流系统将收集到的粪便样本运送至实验室；
5、从粪便样本中提取微生物总dna，对提取的dna通过pacbi o测序平台进行16srrna基因测序；
6、对得到的测序数据进行otu聚类和物种注释，分析所述粪便样本中微生物组成，并筛选出与结直肠癌关联的微生物标志物；
7、使用综合生物分子检测技术在粪便样本中定量检测dna甲基化、蛋白质表达以及代谢产物，根据预先确定的生物标志物面板进行分析，得到分子生物标志物检测结果；
8、根据微生物标志物和分子生物标志物检测结果建立结直肠癌风险评估模型，对模型进行训练和验证，优化对结直肠癌风险的预测；
9、通过结直肠癌风险评估模型对新获取的粪便样本的微生物组序列和分子生物标志物数据进行分析，生成患者的结直肠癌风险评分，根据结直肠癌风险评分生成结直肠癌风险评估报告及诊断报告。
10、作为本发明的进一步方案，使用综合生物分子检测技术在粪便样本中定量检测dna甲基化、蛋白质表达以及代谢产物，包括：
11、使用pcr技术针对特定基因的甲基化状态进行定量分析；通过逆转录pcr间接评估蛋白质表达水平；采用液相色谱-质谱联用(lc-ms)在粪便样本中定量检测和鉴定代谢产物。
12、作为本发明的进一步方案，从粪便样本中提取微生物总dna，包括以下步骤：
13、在生物安全柜中开封样本收集器，取适量粪便样本转移到含有裂解缓冲液的试管中；
14、添加裂解剂，并加入蛋白酶k和溶菌酶，在56℃-60℃温度条件下对细胞壁裂解，然后使用珠磨仪进行物理破碎处理，破坏细胞壁和裂解细胞；
15、采用磁珠吸附法进行dna提取，使用含有乙醇的洗涤缓冲液去除蛋白质、多糖和其他杂质，再将纯化后的dna从磁珠中洗脱出来，使用荧光定量仪器检测dna的浓度；
16、采用1％琼脂糖凝胶对纯化后的dna电泳，评估dna的质量。
17、作为本发明的进一步方案，裂解剂包括1％的sds(十二烷基硫酸钠)和20mm的edta(乙二胺四乙酸)。
18、作为本发明的进一步方案，采用磁珠吸附法进行dna提取，包括以下步骤：
19、通过离心机清除物理破碎后的细胞碎片裂解物，收集含有dna的上清液；
20、将上清液转移到含有特异性吸附材料的吸附磁珠中，在适宜盐浓度和ph值条件下将dna吸附到磁珠上；
21、使用含有乙醇的洗涤缓冲液离心去除蛋白质、多糖和其他杂质，重复洗涤步骤直至杂质被清除，向磁珠中加入洗脱缓冲液，离心收集含有纯化后dna的洗脱液，使用荧光定量仪器检测dna的浓度。
22、作为本发明的进一步方案，清除物理破碎后的细胞碎片裂解物时，在室温下，将离心机转速调节至13000-18000rpm/min，离心处理5分钟，使细胞碎片、未裂解的细胞及细胞器沉淀在管底，收集含dna的上清液即可。
23、作为本发明的进一步方案，对提取的dna通过pacbi o测序平台进行16s rrna基因测序，包括以下步骤：
24、基于一对特异性引物，通过pcr扩增16s rrna基因全长，其中，选用的引物对为：
25、正向引物：27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')
26、反向引物：1492r(5'-tacggytaccttgttacgactt-3’)；
27、纯化pcr产物，对纯化后的pcr产物进行末端修饰处理，添加测序接头，并连接到smrtbe l l dna模板，进行末端修饰和连接测序接头；
28、将smrtbe l l模板装载到pacbio的smrt ce l l中，在pacbio测序平台上运行样品，进行单分子实时(smrt)测序；
29、对获得的测序数据进行质控、otu聚类和物种注释，筛选出与结直肠癌关联的微生物标志物，使用pcr定量检测粪便样本中的dna甲基化、蛋白质表达及代谢产物，以建立基于微生物标志物和分子生物标志物的结直肠癌风险评估模型。
30、作为本发明的进一步方案，在pacbio测序平台上运行样品，进行单分子实时(smrt)测序时，将装载了smrtbe l l模板的smrt ce l l安装到pacbio测序仪中，调节测序运行参数的测序模式、测序时间；启动测序仪，进行smrt测序；其中，测序过程中，dna聚合酶沿着smrtbe l l模板合成互补链，同时通过零模式波导(zmw)捕获并记录荧光信号，测序完成后，根据记录的荧光信号进行质控分析，并对高质量的数据进行otu聚类，物种注释，识别出与结直肠癌关联的微生物标志物。
31、作为本发明的进一步方案，测序数据进行otu聚类和物种注释，包括：
32、使用至少97％相似性阈值将处理过的测序序列聚类为otu；
33、将otu代表性序列与公共数据库比对，进行物种注释，注释结果提供otu对应的细菌属、科、目级别的分类信息；
34、根据物种注释结果，分析样本中的微生物丰度分布，通过比较健康个体与结直肠癌患者样本微生物组成，筛选与结直肠癌关联的微生物标志物；
35、将筛选出的微生物标志物整合入结直肠癌风险评估模型，以对模型进行训练，使用独立数据集进行验证，并优化模型的预测性能。
36、作为本发明的进一步方案，建立结直肠癌风险评估模型，包括以下步骤：
37、将微生物标志物的检测结果和分子生物标志物的检测结果集成到同一数据集，并进行预处理；
38、对处理后的数据集识别标志物，根据每个标志物的区分力分配权重，确定对结直肠癌风险预测有贡献的微生物标志物和分子生物标志物；
39、使用随机森林构建初步的风险评估模型，将数据集分为训练集和测试集，使用训练集来训练模型，确定模型参数；
40、使用测试集对模型进行验证，应用交叉验证调整模型参数，优化模型，并利用优化后的模型，对新样本的微生物和分子生物标志物数据进行分析，得出每个个体的结直肠癌风险评分。
41、与现有技术相比，本发明提供的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，具有以下有益效果：
42、1.无创性检测：通过使用粪便样本进行筛查，相比传统的结肠镜检查，大大降低了患者的身体和心理负担，提高了患者接受筛查的意愿。使用专用的粪便样本收集器，粪便样本收集方便，不需要复杂的设备或者专业人员操作，患者可以自行收集后通过物流安全运输至实验室。
43、2.pacbi o测序技术：使用pacb i o测序平台进行16s rrna基因测序能够提供更全面的微生物组信息，有助于深入了解微生物多样性和微生物与结直肠癌之间的关联。通过otu聚类和物种注释进行微生物标志物的筛选，可以识别粪便样本中与结直肠癌关联的特定微生物标志物，为结直肠癌的早期发现和预防提供更具针对性的生物标志物。
44、3.分子生物标志物的综合分析：结合微生物标志物与分子生物标志物(如dna甲基化、蛋白质表达和代谢产物)的检测，可以从不同层面综合评估结直肠癌的风险，提高筛查的准确性，并通过建立风险评估模型并进行训练验证，可以对结直肠癌风险进行量化评估，优化模型使其预测性能更加精准。
45、4.个性化诊断报告：根据个体的微生物组序列和分子生物标志物数据，生成个性化的结直肠癌风险评估报告，为临床医生提供了更多决策依据，并有助于指导患者的后续临床路径。本发明的筛查方法的高效性和易接受性有利于在人群中广泛开展结直肠癌筛查，有助于早期发现、早期治疗，降低疾病负担，对公共卫生管理具有重要意义。
46、综上所述，本发明的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法不仅为患者提供了一个简便、非侵入性的筛查选择，而且通过专用的粪便样本收集器确保样本质量和生物信息学分析增强了筛查的准确性和可靠性，具有广泛的临床应用前景和研究价值。
47、本发明的这些方面或其他方面在以下实施例的描述中会更加简明易懂。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
1.一种基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，从粪便样本中提取微生物总dna，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，所述裂解剂包括1％的sds和20mm的edta。
4.如权利要求1所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，采用磁珠吸附法进行dna提取，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，清除物理破碎后的细胞碎片裂解物时，在室温下，将离心机转速调节至13000-18000rpm/min，离心处理5分钟，使细胞碎片、未裂解的细胞及细胞器沉淀在管底，收集含dna的上清液即可。
6.如权利要求4所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，对提取的dna通过pacbio测序平台进行16s rrna基因测序，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，基于一对特异性引物，通过pcr扩增16s rrna基因全长时，选用的引物对为：
8.如权利要求6所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，在pacbio测序平台上运行样品，进行单分子实时(smrt)测序时，将装载了smrtbel l模板的smrt cel l安装到pacbio测序仪中，调节测序运行参数的测序模式、测序时间；启动测序仪，进行smrt测序；其中，测序过程中，dna聚合酶沿着smrtbel l模板合成互补链，同时通过零模式波导(zmw)捕获并记录荧光信号，测序完成后，根据记录的荧光信号进行质控分析，并对高质量的数据进行otu聚类，物种注释，识别出与结直肠癌关联的微生物标志物。
9.如权利要求8所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，测序数据进行otu聚类和物种注释，包括：
10.如权利要求9所述的基于粪便样本的结直肠癌筛查方法，其特征在于，建立结直肠癌风险评估模型，包括以下步骤：
