本发明涉及与生物质谱相关的系统生物学、糖蛋白质组学等，尤其是涉及一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法。
背景技术：
1、糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰之一，哺乳动物中超过一半的蛋白质存在糖基化修饰。糖基化能影响许多生物学过程，如免疫防御、细胞生长、细胞间粘附、炎症、信号转导等。o-糖基化发生在丝氨酸(s)和苏氨酸(t)上，o-糖基化程度与肿瘤增殖、侵袭和转移有关。由于以下原因，鉴定o-糖肽比鉴定n-糖肽更困难：(1)o-糖基化没有像n-糖基化的n-x-s/t/c(x≠脯氨酸)那样的共同序列子，并且相邻o-糖基化位点间往往更为密集；(2)在质谱测试中，o-糖肽的化学计量低以及离子化程度差；(3)o-聚糖具有多达八种核心结构(核心1：galβ1-3galnac；核心2：glcnacβ1-6(galβ1-3)galnacα；核心3：glcnacβ1-3galnacα；核心4：glcnacβ1-6(glcnacβ1-3)galnacα；核心5：galnacα1-3galnac a，核心6：glcnacβ1-6galnacα，核心7：galnacα-6galnacα，核心8：galα1-3galnacα)和四个扩展的核心结构，相比之下，n-糖基化只有一个核心结构。蛋白质中有许多丝氨酸和苏氨酸残基，哺乳动物中有数以十万计的o-聚糖。
2、tmt(tandem mass tag)技术是由美国thermo scientific公司研发的一种多肽体外标记技术，广泛用于差异表达蛋白质组分析研究中，该技术采用6重、10重或16重同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，与肽段的氨基发生共价结合反应，然后进行串联质谱分析，可实现同时对6个/10个/16个不同样品中蛋白质的定性和定量分析。
3、tmt标签由三部分组成:报告基团、平衡基团和反应基团，形成2种、6种或10种相对分子质量均等量的异位标签(六标为126、127、128、129、130和131da，十标为126、127n、127c、128n、128c、129n、129c、130n、130c和131da，十六标为126、127n、127c、128n、128c、129n、129c、130n、130c、131n、131c、132n、132c、133n、133c、134n)。tmt标签通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中，分子量标准化部分使任何一种tmt标签标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中，可剪切臂能够优先断裂以便释放报告基团。每个报告基团都有各自独特的分子量，并且能够在ms/ms分析中反应出所标记的多肽的样品丰度，根据报告基团的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。
4、pglyco 3.0软件是首个提出聚糖优先的糖肽搜索引擎，特色是先搜索糖链部分，使用y离子和氧鎓离子将完整的多糖与多糖数据库匹配，通过糖链鉴定的质控，缩小搜索空间从而提高检索速度，并且过滤掉不可靠的糖型从而提高鉴定精度。此外对于含有多个糖基化修饰位点的糖肽，pglyco 3.0采用动态规划算法对糖基化位点进行精准定位。至此，pglyco 3.0实现了从糖链、多肽和糖肽三个层面的质控保证了结果的准确性和可靠性。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
3、一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，具体步骤如下：
4、s1、对控制组与不同的疾病组的样本进行前处理，得到控制组多肽和不同的疾病组多肽；
5、s2、富集o-糖肽：将步骤s1中得到的多肽中的o-糖肽进行富集；
6、s3、tmt标记：对控制组与疾病组富集到的o-糖肽分别进行tmt标记；
7、s4、o-糖肽等比例混合：将控制组及不同的疾病组分别进行tmt标记后的o-糖肽进行等比例混合，得到等比例混合的o-糖肽样品；
8、s5、数据处理分析：将tmt标记后等比例混合的o-糖肽样品依次进行数据分析。
9、进一步地，步骤s1中，所述样本前处理的步骤如下：
10、s1-1、蛋白还原烷基化：对控制组与不同的疾病组蛋白中存在的二硫键进行还原，同时对还原后的巯基进行烷基化保护；
11、s1-2、去除烷基化后的蛋白中的n-多糖；
12、s1-3、蛋白酶切：使用胰蛋白酶(trypsin)酶切，将去除n-多糖的蛋白水解形成多肽。
13、上述更进一步地，步骤s1-1中，通过血液离心法获取控制组与不同的疾病组的血清样本。
14、血清样本里面含的蛋白类物质是比较纯净的，所以需要去除的是其它相对分子质量较小的水溶性杂质，因此获得纯净蛋白的提纯方法与组织中提取蛋白的不一样，采用含10kda mwco膜的超滤离心管进行提纯，利用蛋白质相对分子质量大的特点，分子量大的蛋白会截留在膜的一侧，分子量小的物质会进入膜的另一侧。血清可通过血液离心法获得，以每分钟2500～3000转的速度进行离心，在试管的最上层获得的就是血清样本。
15、不同的疾病组指的是相对于控制组患某种疾病的不同患者个体。
16、上述更进一步地，步骤s1-2中，通过n-糖苷酶f(pngase f酶)去剪切天冬酰胺连接的多糖，从而去除烷基化后的蛋白中的n-多糖，从而排除n-多糖的干扰。
17、上述更进一步地，步骤s1-3中，因为n-多糖的丰度远多于o-多糖，在两者均存在的情况下，o-多糖的质谱信号会被n-多糖掩盖，因此必须先排除n-多糖的干扰。所以选择在蛋白烷基化之后使用n-糖苷酶f(pngase f酶)去剪切天冬酰胺连接的多糖，从而去除烷基化后的蛋白中的n-多糖，从而排除n-多糖的干扰。然后再接着用trypsin酶切，将去除掉n-多糖的蛋白水解成多肽。
18、进一步地，步骤s2中，富集多肽样本中o-糖肽的方法为：
19、使用商用rax小柱、zic-hilic或其它填料对步骤s1中得到的多肽中的o-糖肽进行富集。
20、进一步地，步骤s3中，tmt标记试剂里包含不同标签的稳定同位素试剂，控制组选择其中一个标签进行标记，疾病组中不同的个体选择其中不同的任一标签进行标记即可，tmt标记的优势是可以一次性分析多个疾病组个体相对于同一控制组样本中蛋白/糖蛋白水平表达情况的变化。
21、进一步地，步骤s4中，所述等比例混合指按照控制组和疾病组标记后完整o-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
22、进一步地，步骤s5中，将tmt标记后的o-糖肽样品依次进行数据分析具体如下：
23、s5-1、将等比例混合后的o-糖肽样品进行rplc-ms/ms分析得到一个数据组；
24、s5-2、使用pglyco 3.0数据库对o-糖肽进行，然后再使用数据库对完整n-糖肽进行搜索并排除其干扰；
25、s5-3、通过pglycoquant_v.1对o-糖肽进行定量分析，得到o-糖肽的id及疾病组组每一条o-糖肽相对于控制组的相对比例，即可得到疾病条件下所有o-糖肽的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的o-糖肽所属的蛋白即为非疾病诊断治疗目的方法得到的目标糖蛋白，所述目标糖蛋白为与该疾病发生、发展相关的糖蛋白。
26、上述更进一步地，步骤s5-1中，在液相色谱中控制组体系和疾病组体系的o-糖肽同时洗脱，然后同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量得到数据组。
27、b/y离子指的是在进行质谱分析时，样品中蛋白质肽段碎裂后产生的特定碎片离子，通常是质谱分析中通过离子轰击肽段后得到的。在蛋白质谱中，b/y离子是非常重要的信息来源。通过对b/y离子的分析，可以获得关于肽段序列、修饰和变异等信息，进而推断出蛋白质的结构和功能。
28、串联质谱(ms/ms)技术包括多级质谱和碰撞诱导解离等不同的碎裂方式，可以进一步解析b/y离子，获得更详细的肽段序列和修饰信息。总之，蛋白质谱中的b/y离子是获取肽段信息的重要途经之一，对于解析蛋白质的结构和功能具有重要意义。
29、如图4所示，不同的碎裂模式，可以得到不同的碎片离子：a/x，b/y，c/z。b/y离子的碎裂存在于肽键的c-n键处。
30、hcd(high energy collision dissociation)即高能碰撞解离，是质谱中样品碎裂获得离子碎片的一种方式，hcd专指orbitrap类质谱仪器中离子在高能碰撞池或多级离子通道中的碎裂方式，相比于cid(collison-induced dissociation，碰撞诱导解离)碎裂方式能获得低m/z的碎片离子，产生的碎片相对更多，谱图质量更高。肽段hcd的碎片裂解模式如图5所示。
31、质谱分析中的一级质谱和二级质谱是指质谱实验过程中的两个不同阶段。
32、一级质谱(first-order mass spectrum，又称为母离子谱)。一级质谱是质谱实验的第一阶段，也是质谱分析的基本阶段。在这个阶段，分子样品被电离为带电粒子(离子)，并在质谱仪中根据质荷比(m/z)进行分离。在质谱仪的检测器上，这些离子产生信号，形成一级质谱。一级质谱是一个包含离子质荷比(m/z)与相应离子相对强度(通常用百分比表示)的图表。一级质谱主要用于分析样品中各种离子的质荷比分布，从而了解其分子量和离子组成。
33、二级质谱(second-order mass spectrum，又称为子离子谱或串联质谱)。二级质谱是质谱实验的第二阶段，通常用于对某一特定母离子进行更深入的研究。在这个阶段，选定的母离子(来源于一级质谱中的某个特定离子)在质谱仪中被进一步碎裂成子离子。然后，这些子离子根据质荷比(m/z)进行分离，最后在检测器上产生信号，形成二级质谱。二级质谱是一个包含子离子质荷比(m/z)与相应离子相对强度(通常用百分比表示)的图表。二级质谱主要用于揭示目标母离子的内部结构和组成，有助于深入了解分子的化学结构和反应途径。
34、一级质谱和二级质谱的区别在于后者会用一个碎片源来打碎原始的分子离子，因此二级质谱可以更准确地确定分子结构。此外，二级质谱可以将某个化合物的化学成分与其它复杂物的化合物结构进行比较。由此，可以更准确地确定某些生物或药物的含量。而一级质谱在分离小分子物质方面更加先进。通过对一级质谱和二级质谱的分析，研究人员可以从多个层面对分子样品进行结构鉴定和定量分析。同时，一级质谱和二级质谱的联合应用也为复杂样品的分析提供了强有力的支持。
35、上述更进一步地，步骤s5-2中，对于重叠的完整o-糖肽和n-糖肽，如果观察到n(glcnac)-x-s/t/c的任何肽骨架片段离子作为n-糖基化的证据，则去除相应的o-糖肽id从而得到o-糖肽的定性结果。
36、上述更进一步地，步骤s5-2中，所述数据库为gpseeker数据库。
37、现在已有不同的糖肽质谱分析软件可用于定性或定量分析完整n-糖肽，这些分析软件一般由相关研究人员进行开发，有些已经商用或开源，如glycanfinder、pglyco、glyco-decipher等，数据库一般以uniprot中选择的不同物种的蛋白数据库为基础再结合完整n-糖肽糖链的可能糖型，选择不同的静态翻译后修饰以及相应的标记标签得到相应的完整n-糖肽数据库，然后对得到的质谱谱图进行解析，这个只是分析工具，不同软件的使用有不同教程，都是成熟的分析软件和方法。本发明中使用的gpseeker软件的开发原理及使用流程可参考文献(j.proteome res.2019,18,7,2885–2895)。相对比例即定量数据的获得通过比较同一完整n-糖肽实验组相对于对照组峰强度即可获得。峰强度数据通过分析软件可以获得。
38、与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：
39、1、本发明的创新点在于开发了一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，基于tmt标记，rplc-ms/ms分析，pglyco3.0数据库搜索结合手动确认进一步排除n-糖肽的流程，该方法得到的有关o-糖肽的定性及定量数据更为准确，可信。
40、2、本发明中蛋白来源于血清，血清中的蛋白相对较纯，需要去除的是其它相对分子质量较小的水溶性杂质，因此本发明采用含10kda mwco膜的超滤离心管进行提纯，利用蛋白质相对分子质量大的特点，分子量大的蛋白会截留在膜的一侧，分子量小的物质会进入膜的另一侧。所截留分子的分子量至少是装置内pes膜mwco标示值的两倍，适用于生物样品的浓缩、脱盐和缓冲液置换。
1.一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s1中，所述样本前处理的步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s1-1中，通过血液离心法获取控制组与不同的疾病组的血清样本。
4.根据权利要求2所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s1-2中，通过n-糖苷酶f去剪切天冬酰胺连接的多糖，从而去除烷基化后的蛋白中的n-多糖，从而排除n-多糖的干扰。
5.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s2中，富集多肽样本中o-糖肽的方法为：
6.根据权利要求1所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s4中，所述等比例混合指按照对照组和实验组标记后完整o-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
7.根据权利要求6所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s5中，将tmt标记后的o-糖肽样品依次进行数据分析具体如下：
8.根据权利要求7所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s5-1中，在液相色谱中控制组体系和疾病组体系的o-糖肽同时洗脱，然后同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量得到数据组。
9.根据权利要求7所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s5-2中，对于重叠的完整o-糖肽和n-糖肽，如果观察到n(glcnac)-x-s/t/c的任何肽骨架片段离子作为n-糖基化的证据，则去除相应的o-糖肽id从而得到o-糖肽的定性结果。
10.根据权利要求7所述的一种基于质谱的完整o-糖肽相对定量分析方法，其特征在于，步骤s5-2中，所述数据库为gpseeker数据库。
