本发明涉及与生物质谱相关的系统生物学、糖蛋白质组学等，尤其是涉及一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法。
背景技术：
1、糖基化是蛋白质上常见的翻译后修饰，哺乳动物中超过一半的蛋白质存在糖基化修饰。n-连接糖基化(简称n-糖基化)是糖基化中最为普遍的类型，n-糖基化修饰在n-x-s/t/c(x≠p)序列子上，n-多糖具有由2个n-乙酰葡糖胺和3个甘露糖组成的核心结构；其中1个n-乙酰葡糖胺与蛋白相连。n-糖基化表现出蛋白质氨基酸序列上修饰位点的宏观异质性和单糖组成、序列结构、链接结构、异头异构和立体异构等多个结构维度的微观异质性。n-糖基化修饰以位点和结构特异性的方式调节n-糖蛋白的结构和功能。n-糖蛋白在分子和细胞过程中发挥各种关键作用，如蛋白质分子折叠、细胞识别和通讯、信号转导、免疫细胞激活、抗原呈递，并参与疾病的发生和发展。n-糖蛋白在疾病状态下的差异表达需要通过位点和结构特异性定量分析来表征。
2、n-糖基化可以在完整n-糖肽层次上进行分析。完整n-糖肽可以由糖蛋白通过合适的蛋白酶，例如胰蛋白酶(trypsin)酶切糖蛋白形成糖肽与肽段的混合物，然后对n-糖肽进行富集分离获得。同位素标记技术主要是通过一级质谱的信号进行定量，由于同位素不改变化学性质，多肽样本在色谱中仍然同时洗脱，进入质谱，同时在一级谱图上不会区分，在将前体离子进行解离时，碎片信号会在二级谱上显示相差1da的报告离子，达到定量的效果。目前尚未见集富集和定量稳定同位素标记完整n-糖肽于一体的报道。
3、基于silac的细胞内标记和基于tmt的体外标记，由于靶向氨基酸的非完全标记(如重的赖氨酸或精氨酸在silac中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非选择性标记(如苏氨酸的tmt标记)，其应用范围受到了比较大的限制。同位素标记中由于同位素不改变化学性质，多肽样本在色谱中仍然同时洗脱，进入质谱，同时在一级谱图上不会区分，在将前体离子进行解离时，碎片信号会在二级谱上显示相差1da的报告离子，达到定量的效果。
4、申请人前期在整体蛋白质、n-多糖和完整n-糖肽定性定量分析方面已经做了较多工作，奠定了相关基础。在数据库新算法和引擎发展方面，公布号为cn103389335a的中国专利公布了一种鉴定生物大分子的分析装置和方法。公布号为cn104765984a的中国专利公布了一种生物质谱数据库快速建立与搜索的方法。公布号为cn104359967a的中国专利公布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。在上述专利中公布的同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelope fingerprinting，ief)，直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应时间；根据各离子中是否有同位素峰缺失和相对强度的偏差，能够对理想及非理想实验数据进行很好区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效解析。基于该算法申请人成功地开发了完整n-糖肽数据库搜索引擎gpseeker。
5、在定量标记方面，公布号为cn105137088a的中国专利公布了一种整体蛋白质定量分析方法。公布号为cn105242050a的中国专利公布了一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法。公布号为cn105785048a的中国专利公布了基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法。公布号为cn105866429a的中国专利公布了基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法。公布号为cn106093224a的中国专利公布了一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法。公布号为cn106990159a的中国专利公布了一种基于全准同重二乙基标记的蛋白质定量方法。公布号为cn110261500a的中国专利公布了一种基于质谱的完整n-糖肽相对定量方法。
6、传统的准等重同位素标记技术大多采用13c和d的组合实现准等重标记，但由于d和h在色谱中可能存在保留时间的差异，导致标记两种多肽不能完全同时洗脱进入质谱进行检测，这会带来一定的定量误差。二乙基(同位素，isotopic或同重，isobaric)标记由于其试剂易得，标记效率高，在多肽定量方面已得到了广泛的研究和应用。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法。
2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
3、一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，具体步骤如下：
4、s1、对实验组和对照组的样本进行前处理，得到实验组多肽和对照组多肽；
5、s2、对多肽进行同位素标记：对实验组和对照组多肽中的赖氨酸ε-氨基和n端氨基分别进行稳定同位素二乙基标记，实验组标记为：-n(c2h5)2，对照组标记为：-n(13c2h5)2；
6、s3、多肽等比例混合：将实验组与对照组分别标记后的多肽进行等比例混合，得到等比例混合后的多肽样本；
7、s4、完整n-糖肽富集：将等比例混合后的多肽样本中完整n-糖肽进行富集；
8、s5、数据处理分析：将富集后的完整n-糖肽样品依次进行数据分析。
9、进一步地，步骤s1中，所述样本前处理的步骤如下：
10、s1-1、蛋白提取：对来自不同生理或病理条件下的样本进行蛋白提取；
11、s1-2、蛋白还原烷基化：对步骤s1-1中提取后的蛋白中的二硫键进行还原，同时对还原后的巯基进行烷基化保护；
12、s1-3、蛋白酶切：使用胰蛋白酶(trypsin)酶切还原烷基化后的蛋白，得到多肽。
13、进一步地，步骤s1中，所述样本包括组织、细胞和体液样本。
14、进一步地，步骤s2中，实验组和对照组的质量差异为4.01342da。
15、稳定同位素二乙基标记会使实验组与对照组中的相同完整n-糖肽间存在质量差异，每一个标记位点会相差4.01342da，便于在同一张质谱图里将来自于实验组与对照组的同一种n-糖肽区分开，可以分别测定其含量然后进行定量分析，计算出实验组相对于对照组的完整n-糖肽的表达量。为了准确测定实验组相对于对照组蛋白的表达量是如何变化的，实验组与对照组蛋白经过处理后得到完整n-糖肽，在等比例混合前必须分别进行区分标记，不然混合之后相同的完整n-糖肽在质谱图中显示的是同样的峰型，是区分不开的，因此需要选择同位素标记。
16、进一步地，步骤s3中，所述等比例混合指按照对照组和实验组标记后完整n-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
17、进一步地，步骤s4中，富集多肽样本中完整n-糖肽的方法为：
18、使用商用rax小柱、zic-hilic或其它填料对标记后等比例混合的多肽样本中完整n-糖肽进行富集。
19、进一步地，步骤s5中，将富集后的完整n-糖肽样品依次进行数据分析的方法具体如下：
20、s5-1、将富集后的完整n-糖肽样品进行rplc-ms/ms分析得到一个数据组；
21、s5-2、对步骤s5-1中得到的数据组进行数据库搜索，得到完整n-糖肽的id及实验组每一条完整n-糖肽相对于对照组的相对比例，即可得到疾病条件下所有完整n-糖肽的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的完整n-糖肽所属的蛋白即为非疾病诊断治疗目的方法得到的目标糖蛋白，所述目标糖蛋白为与该生理或病理条件发生、发展相关的糖蛋白。
22、上述更进一步地，步骤s5-1中，在液相色谱中实验组体系与对照组体系的完整n-糖肽同时洗脱，然后同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量得到数据组。
23、b/y离子指的是在进行质谱分析时，样品中蛋白质肽段碎裂后产生的特定碎片离子，通常是质谱分析中通过离子轰击肽段后得到的。在蛋白质谱中，b/y离子是非常重要的信息来源。通过对b/y离子的分析，可以获得关于肽段序列、修饰和变异等信息，进而推断出蛋白质的结构和功能。
24、串联质谱(ms/ms)技术包括多级质谱和碰撞诱导解离等不同的碎裂方式，可以进一步解析b/y离子，获得更详细的肽段序列和修饰信息。总之，蛋白质谱中的b/y离子是获取肽段信息的重要途经之一，对于解析蛋白质的结构和功能具有重要意义。
25、如图3所示，不同的碎裂模式，可以得到不同的碎片离子：a/x，b/y，c/z。b/y离子的碎裂存在于肽键的c-n键处。
26、hcd(high energy collision dissociation)即高能碰撞解离，是质谱中样品碎裂获得离子碎片的一种方式，hcd专指orbitrap类质谱仪器中离子在高能碰撞池或多级离子通道中的碎裂方式，相比于cid(collison-induced dissociation，碰撞诱导解离)碎裂方式能获得低m/z的碎片离子，产生的碎片相对更多，谱图质量更高。肽段hcd的碎片裂解模式如图4所示。
27、质谱分析中的一级质谱和二级质谱是指质谱实验过程中的两个不同阶段。
28、一级质谱(first-order mass spectrum，又称为母离子谱)。一级质谱是质谱实验的第一阶段，也是质谱分析的基本阶段。在这个阶段，分子样品被电离为带电粒子(离子)，并在质谱仪中根据质荷比(m/z)进行分离。在质谱仪的检测器上，这些离子产生信号，形成一级质谱。一级质谱是一个包含离子质荷比(m/z)与相应离子相对强度(通常用百分比表示)的图表。一级质谱主要用于分析样品中各种离子的质荷比分布，从而了解其分子量和离子组成。
29、二级质谱(second-order mass spectrum，又称为子离子谱或串联质谱)。二级质谱是质谱实验的第二阶段，通常用于对某一特定母离子进行更深入的研究。在这个阶段，选定的母离子(来源于一级质谱中的某个特定离子)在质谱仪中被进一步碎裂成子离子。然后，这些子离子根据质荷比(m/z)进行分离，最后在检测器上产生信号，形成二级质谱。二级质谱是一个包含子离子质荷比(m/z)与相应离子相对强度(通常用百分比表示)的图表。二级质谱主要用于揭示目标母离子的内部结构和组成，有助于深入了解分子的化学结构和反应途径。
30、一级质谱和二级质谱的区别在于后者会用一个碎片源来打碎原始的分子离子，因此二级质谱可以更准确地确定分子结构。此外，二级质谱可以将某个化合物的化学成分与其它复杂物的化合物结构进行比较。由此，可以更准确地确定某些生物或药物的含量。而一级质谱在分离小分子物质方面更加先进。通过对一级质谱和二级质谱的分析，研究人员可以从多个层面对分子样品进行结构鉴定和定量分析。同时，一级质谱和二级质谱的联合应用也为复杂样品的分析提供了强有力的支持。
31、上述更进一步地，步骤s5-2中，所述数据库为gpseeker数据库。
32、上述更进一步地，步骤s5-2中，步骤s5-2中，通过正向、反向、实验组标记-n(c2h5)2、对照组标记-n(13c2h5)2组合创建完整n-糖肽数据库lf、lr、hf、hr，针对完整n-糖肽数据库lf、lr、hf、hr分别搜索每个lc-ms/ms原始数据集，设置相关参数，筛选并输出完整的n-糖肽谱匹配，将lf和lr或hf和hr的目标和诱饵gpsm组合，按p分的升序排序，使用标准重复去除肽序列、n-糖苷和n-聚糖连接后，将lf和hf组合以获得完整n-糖肽的id；
33、搜索每个完整的n-糖肽id的配对前体离子，将来自每个前体离子的top3同位素峰的总丰度用于相对定量，比较同一完整n-糖肽实验组相对于对照组峰强度获得实验组每一条完整n-糖肽相对于对照组的相对比例。
34、现在已有不同的糖肽质谱分析软件可用于定性或定量分析完整n-糖肽，这些分析软件一般由相关研究人员进行开发，有些已经商用或开源，如glycanfinder、pglyco、glyco-decipher等，数据库一般以uniprot中选择的不同物种的蛋白数据库为基础再结合完整n-糖肽糖链的可能糖型，选择不同的静态翻译后修饰以及相应的标记标签得到相应的完整n-糖肽数据库，然后对得到的质谱谱图进行解析，这个只是分析工具，不同软件的使用有不同教程，都是成熟的分析软件和方法。本发明中使用的gpseeker软件的开发原理及使用流程可参考文献(j.proteome res.2019,18,7,2885–2895)。相对比例即定量数据的获得通过比较同一完整n-糖肽实验组相对于对照组峰强度即可获得。峰强度数据通过分析软件可以获得。
35、与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：
36、1、本发明在实验组与对照组样本在多肽层面上进行同位素标记混合后可预留出一部分多肽样本，再进行完整n-糖肽富集，方便在多肽与糖肽上进行定性定量分析并进行比较，更有利于挖掘出蛋白质组学与糖蛋白组学两个层面的生物信息学之间的关联。
37、2、本发明可以同时对多肽和完整n-糖肽都进行标记，可以一次性对标记后的混合多肽样本进行完整n-糖肽富集而避免了多次进行富集操作，操作更为简便省时，另外可以一次性在多肽和完整n-糖肽两个层面上进行分析与定性定量比较，避免了分开两次在这两个层面上进行标记过程中引入的变量误差，能使结果更为可靠。
38、3、相对于二甲基标记，本发明采用二乙基标记，将a1离子的质量增加28da，能较好地兼顾最低质量端a1离子和高质量端的离子的全面检测。
39、4、本发明的定量方法对完整n-糖肽任意位置赖氨酸ε-氨基及n端氨基酸上的所有氨基进行稳定同位素二乙基标记，标记效率高，准确度高，适用于基于高分辨串级质谱的完整n-糖肽的定量分析。
40、5、使用完整n-糖肽搜索引擎gpseeker，对相应高分辨串级质谱中包含稳定同位素二乙基标记基团的碎片离子进行同位素轮廓指纹比对原位数据解析，由于数据库的糖型更为完善，能鉴定到的完整n-糖肽id数会更多，包含了n-多糖的位点、组成、链接结构、异头异构等不同信息。
41、6、本技术中蛋白来源于肝脏组织提取的蛋白，历经匀浆、裂解、离心后取上清液、丙酮沉淀和尿素溶液重溶等步骤得到纯净的蛋白溶液，然后用二硫苏糖醇(dtt)溶液对蛋白中的二硫键(-s-s-)进行还原，还原成巯基(-sh)后就打断了蛋白的二硫键。然后使用碘乙酰胺(iaa)溶液进行烷基化，主要目的是封闭还原后的巯基，避免其再次形成二硫键。烷基化可以减少在实验阶段对蛋白的人为降解和修饰，释放尽可能多的肽段，以便进行质谱检测。也便于后续trypsin酶进行酶切。
42、7、已有的文献和报道是先分别富集出实验组与对照组的完整n-糖肽后再进行分别标记，是在完整n-糖肽水平上进行标记，然后再进行等比例混合。本发明是先分别在实验组与对照组多肽水平上进行分别标记，然后进行等比例混合后再进行完整n-糖肽富集。优势是可以同时对多肽和完整n-糖肽都进行标记，可以一次性进行完整n-糖肽富集而避免了多次进行富集操作，操作更为简便省时，另外可以同时在多肽和完整n-糖肽两个层面上进行分析与定性定量比较。
1.一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s1中，所述样本前处理的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s1中，所述样本包括组织、细胞和体液样本。
4.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s2中，实验组和对照组的质量差异为4.01342da。
5.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s3中，所述等比例混合指按照对照组和实验组标记后完整n-糖肽的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
6.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s4中，富集多肽样本中完整n-糖肽的方法为：
7.根据权利要求1所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s5中，将富集后的完整n-糖肽样品依次进行数据分析的方法具体如下：
8.根据权利要求7所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s5-1中，在液相色谱中实验组体系与对照组体系的完整n-糖肽同时洗脱，然后同时进入质谱进行检测，通过二级质谱的b/y离子进行相对定量得到数据组。
9.根据权利要求7所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s5-2中，所述数据库为gpseeker数据库。
10.根据权利要求7所述的一种完整n-糖肽同时富集与同位素标记定量分析方法，其特征在于，步骤s5-2中，通过正向、反向、实验组标记-n(c2h5)2、对照组标记-n(13c2h5)2组合创建完整n-糖肽数据库lf、lr、hf、hr，针对完整n-糖肽数据库lf、lr、hf、hr分别搜索每个lc-ms/ms原始数据集，设置相关参数，筛选并输出完整的n-糖肽谱匹配，将lf和lr或hf和hr的目标和诱饵gpsm组合，按p分的升序排序，使用标准重复去除肽序列、n-糖苷和n-聚糖连接后，将lf和hf组合以获得完整n-糖肽的id；
