背景技术：
1、已经使用遗传修饰的微生物(例如，细菌)将治疗分子递送至粘膜组织。参见例如steidler,l.,等，nat.biotechnol.2003,21(7):785-789；和robert s.和steidler l.，microb.cell fact.2014,13增补1:s11。
2、之前已经描述了产生白介素10(il-10)的乳酸菌，并且已经描述了粘膜给予的il-10和/或胰岛素或胰岛素原用于治疗1型糖尿病(t1d)。参见例如，国际专利申请公开号wo2007/063075；robert s.等,diabetes 2014,63:2876-2887；steidler等,nat.biotechnol.2003,21(7):785-789；和takiishi t.等,j.clin.invest.2012,122(5):1717-1725。
3、然而，本领域仍然需要这样的经遗传修饰的细菌菌株，其稳定、组成型表达超过一种生物活性的多肽并且适合用于临床应用，例如，用于治疗t1d。本发明解决了这些需要。
技术实现思路
1、本公开提供了遗传修饰的微生物，其包含编码il-10和胰岛素原(pins)的经染色体整合的核酸，制备这类微生物的方法，以及使用这类微生物的方法。这些遗传修饰的微生物可以适用于人类疗法，包括但不限于治疗糖尿病，例如，t1d。
2、微生物和组合物
3、本公开提供了微生物，例如，革兰氏阳性菌，如乳酸菌(lab)，其包含编码白介素-10(il-10)多肽的外源性核酸，和编码t1d特异性抗原如胰岛素原(pins)多肽的外源性核酸，其中编码il-10多肽的外源性核酸和编码t1d特异性抗原(例如，pins多肽)的外源性核酸两者经染色体整合，即，被整合到细菌染色体中(或位于其上)。
4、微生物可以是革兰氏阳性细菌，如lab。所述lab可以是乳球菌(lactococcus)种细菌。在一些实施方式中，lab是乳杆菌(lactobacillus)种或双歧杆菌(bifidobacteria)种。在一些实施方式中，lab可以是乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。所述lab可以是乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactis subspecies cremoris)。另一示例性lab是乳酸乳球菌株mg1363。参见例如，gasson,m.j.,j.bacteriol.1983,154:1-9。
5、在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，il-10多肽是人il-10(hil-10)。在其他实例中，il-10是il-10变体多肽，例如，包括至少1个点突变，例如，以增加细菌的il-10多肽表达。在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，il-10是“成熟”人il-10(hil-10)，即，不存在其信号肽。在一些实施方式中，当对成熟肽中氨基酸进行计数时，hil-10在2位包含脯氨酸(pro)到丙氨酸(ala)取代。参见例如seq id no:1。这类多肽述于例如steidler等,nat.biotechnol.2003,21(7):785-789中，其公开内容通过引用其全部内容纳入本文。在一些实例中，il-10多肽是野生型人il-10。在其他实例中，il-10多肽是不存在其自身信号肽的野生型人il-10，并且具有与seq id no:1至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在其他实例中，编码il-10多肽的外源性核酸具有与seq id no:2至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的核苷酸序列。
6、在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，t1d特异性抗原多肽是pins多肽，如人pins(hpins)，例如，野生型pins。在一些实例中，pins多肽具有与seq id no:5至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。野生型pins可由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与seq id no:6或seq id no:7至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在其他实例中，pins多肽是不存在其信号肽的人pins，并且具有与seq id no:3至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在其他实例中，编码pins多肽的外源性核酸具有与seq id no:4至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的核苷酸序列。
7、在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，lab)表达(例如，组成型表达)il-10多肽。在其他实例中，微生物(例如，lab)组成型表达并分泌il-10多肽(例如，hil-10)。在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，lab组成型表达t1d特异性抗原多肽(例如，pins多肽)。在其他实例中，微生物(例如，lab)组成型表达并分泌t1d特异性抗原(例如，pins)多肽。在其他实例中，微生物(例如，lab)组成型表达并分泌il-10多肽(例如，hil-10)和tid特异性抗原(例如，pins)多肽(例如，hpins)。
8、在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，编码hil-10多肽的外源性核酸位于hlla启动子(phlla)如乳酸乳球菌phlla的3’处。在根据该实施方式中的一些实例中，编码il-10多肽的外源性核酸由phlla转录调节。在其他实例中，lab包括il-10表达盒，其包含phlla启动子(例如，乳酸乳球菌phlla)，il-10分泌序列(例如，位于phlla的3’处)，和编码il-10多肽的外源性核酸(例如，位于il-10分泌序列的3’处)。在一些实例中，il-10表达盒经染色体整合。在一些实例中，il-10表达盒经染色体整合，从而替换或部分替换另一基因。在根据该实施方式的一些实例中，il-10表达盒在thya基因座处经染色体整合，例如替换内源性thya基因，如steidler等,nat.biotechnol.2003,21(7):785-789中所述。在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，il-10分泌序列是编码未鉴定的分泌的45-kda蛋白质(usp45)的分泌前导序列的核苷酸序列。这类分泌序列在本文中称之为ssusp45。在一些实例中，ssusp45具有与seq id no:10至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列。在一些实例中，ssusp45由这样的核酸序列编码，所述核酸序列与seq id no:11或seq id no:12至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实例中，il-10表达盒中的ssusp45由这样的核酸序列编码，所述核酸序列与seq id no:11至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实例中，il-10表达盒这样阐释：phlla>>ssusp45>>hil-10。示例性的il-10表达盒的核苷酸序列述于图11。
9、在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸位于gapb启动子的3’处，例如，对微生物(例如，lab)为内源性的gapb启动子。在根据任何上述实施方式中任一项的其他实例中，编码tid特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸受gapb启动子转录调节。在其他实例中，编码tid特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸位于gapb基因(gapb)和其gapb启动子的3’。在其他实例中，lab包含第一多顺反子表达盒(例如，双顺反子)，其包含位于gapb基因5’处的gapb启动子，t1d特异性抗原分泌序列(例如，pins分泌序列)(例如，位于gapb的3’处)，和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸(例如，pins分泌序列的3’处)。在根据该实施方式的一些实例中，多顺反子表达盒还包括基因间区域，例如，gapb和pins分泌序列之间。在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，gapb启动子和gapb基因对微生物(例如，lab)是内源性的。在一些实例中，pins分泌序列是ssusp45。在上述实施方式的其他实例中，第一多顺反子表达盒经染色体整合。在其他实例中，第一多顺反子表达盒这样阐释：pgapb>>gapb>>基因间区域>>ssusp45>>pins。在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，第一多顺反子表达盒中的基因间区域是rpmd基因5’基因间区域(即，rpmd前的区域)。在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，rpmd具有seq id no:8的核苷酸序列(其包括第一基因的终止密码子，以及第二基因的起始密码子)。不存在起始和终止密码子的情况下，基因间区域rpmd具有根据seq id no:9的核酸序列。
10、在根据上述实施方式中任一项的一些实例中，微生物(例如，lab)还包含编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸，例如，otsb，如大肠杆菌otsb。在根据任何这些实施方式的一些实例中，编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸经染色体整合。在一些实例中，编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸经染色体整合未鉴定分泌的45-kda蛋白质基因(usp45)的3’。在根据该实施方式的一些实例中，lab包含第二多顺反子表达盒，其包含usp45启动子，usp45基因(例如，启动子的3’)，和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸(例如，usp45基因的3’)。在一些实例中，第二多顺反子表达盒进一步包含介于usp45基因和编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的外源性核酸之间的基因间区域。在一些实例中，第二多顺反子表达盒这样阐释：pusp45>>usp45>>基因间区域>>otsb。在根据这些实施方式的一些实例中，基因间区域是如本文上述的rpmd(例如，具有seq id no:8或seq id no:9)。然后，第二多顺反子表达盒可以这样阐释：pusp45>>usp45>>rpmd>>otsb。
11、在根据任何上述实施方式的一些实例中，在微生物(例如，lab)中破坏或失活海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(trepp)。例如，已经通过去除trepp基因或其片段将trepp失活，或已经通过插入终止密码子将trepp破坏。因此，在根据这些实施方式的一些实例中，微生物(例如，lab)缺少trepp活性。
12、在根据任何上述实施方式的其他实例中，已经在微生物(例如，lab)中破坏或失活纤维二糖特异性pts系统iic组分基因(ptcc)。例如，已经通过插入终止密码子破坏ptcc，或已经通过去除ptcc或其片段使ptcc失活。因此，在根据这些实施方式的一些实例中，微生物(例如，lab)缺少ptcc活性。
13、在根据任何上述实施方式中任一项的一些实例中，lab进一步包含编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因。在一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因对lab为内源性的。在一些实例中，lab过表达编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因。在根据这些实施方式的一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因位于外源性启动子例如hlla启动子(phlla)的3’处。例如，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因受phlla转录调节。在根据这些实施方式的一些实例中，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因选自llmg_0453、llmg_0454和其任何组合。在一些实例中，llmg_0453和llmg_0454由phlla转录调节。
14、在一些实例中，根据上述实施方式中任一项，编码一个或多个海藻糖转运体的一个或多个基因包含编码两个海藻糖转运体的两个基因，其中基因间区域位于两个基因之间。在一些实例中，基因间区域是rpmd，例如，具有seq idno:8或seq id no:9。在一些实例中，微生物(例如，lab)包含多顺反子表达盒，其包含编码两个不同海藻糖转运体(转运体1和转运体2序列)的两个核酸序列(例如，基因)以及介于编码两个不同海藻糖转运体的两个核酸之间的基因间区域。这类表达盒可以这样阐释：phlla>>转运体1>>基因间区域>>转运体2。在根据这些实施方式的一些实例中，基因间区域是如本文上述的rpmd(例如，具有seqid no:8或seq id no:9)。然后，多顺反子表达盒可以这样阐释：phlla>>转运体1>>rpmd>>转运体。
15、因此，在一些实施方式中，lab在单个菌株中包含数个有用的特征。在一实施方式中，lab是乳酸乳球菌，其包含
16、(a)染色体整合的启动子>>分泌信号>>治疗性蛋白质，如白介素、抗原或酶；
17、(b)染色体整合的启动子>>信号肽>>任选的第二治疗性蛋白质。
18、(c)突变和插入的组合以促进海藻糖累积，其将增强lab针对胆汁盐和干燥的生存能力。这些突变选自：
19、(i)一个或多个染色体整合的海藻糖转运体，如phlla>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
20、(ii)位于usp45(gene id:4797218)下游的染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsb；gene id:1036914)以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；
21、(iii)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(trepp；geneid:4797140)；和
22、(iv)失活的纤维二糖特异性pts系统iic组分(gene id:4796893)，ptcc，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
23、lab可以包含用于生物容纳的营养缺陷型突变，如thya。
24、在一实施方式中，lab是乳酸乳球菌，其包含
25、(a)染色体整合的启动子>>分泌信号>>hil-10以由lab分泌成熟hil-10，如phlla>>ssusp45>>hil-10；
26、(b)染色体整合的启动子>>分泌信号>>pins，以由lab分泌成熟pins；如pgapb>>gapb>>基因间区域>>ssusp45>>pins。基因间区域可以是，例如，rpmd；
27、(c)突变和插入的组合以促进海藻糖累积，其将增强lab针对胆汁盐和干燥的生存能力。这些突变选自：
28、(i)一个或多个染色体整合的海藻糖转运体，如phlla>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
29、(ii)位于usp45(gene id:4797218)下游的染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsb；gene id:1036914)以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；
30、(iii)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(trepp；geneid:4797140)；和
31、(iv)失活的纤维二糖特异性pts系统iic组分(gene id:4796893)，ptcc，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
32、lab也可以包含用于生物容纳的营养缺陷型突变，如thya。
33、在一实施方式中，lab是乳酸乳球菌，其具有：
34、(a)thya突变，用于生物容纳
35、(b)染色体整合的phlla>>ssusp45>>hil-10以由lab分泌成熟hil-10；
36、(c)染色体整合的pgapb>>gapb>>基因间区域>>ssusp45>>pins，其中基因间区域选自rpmd，以由lab分泌成熟pins；
37、(d)一个或多个染色体整合的海藻糖转运体，如phlla>>转运体1>>基因间区域>>转运体2，如llmg_0453和/或llmg_0454，用于摄取海藻糖；
38、(e)失活的(例如，通过基因缺失)海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(trepp；gene id:
39、4797140)；
40、(f)染色体整合的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因(otsb；gene id:1036914)(位于
41、usp45(gene id:4797218)下游处以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；和
42、(g)失活的纤维二糖特异性pts系统iic组分(gene id:4796893)，ptcc，(例如，446的密码子位置30处的tga；tga30)。
43、本公开还提供了包含本文所述微生物(例如，lab)的组合物，例如，根据上述实施方式中任一项的微生物(例如，lab)。
44、本公开还提供了包含本文所述微生物(例如，lab)的药物组合物，例如，根据上述实施方式中任一项的微生物(例如，lab)，并且还包含药学上可接受的运载体。
45、本公开还提供了微生物悬浮液(例如，细菌悬浮液)，其包含根据上述实施方式中任一项的微生物(例如，lab)，并且还包含溶剂和稳定剂。在根据该实施方式的一些实例中，溶剂选自水、油及其任意组合。例如，本公开提供了细菌悬浮液，其包含本公开的lab，水性混合物(例如，饮品)和稳定剂。示例性的稳定剂选自蛋白质或多肽(例如，糖蛋白)，肽，单糖、二糖或多糖，氨基酸，凝胶，脂肪酸，多元醇(例如，山梨醇，甘露醇或纤维醇)，盐(例如，氨基酸盐)或其任何组合。
46、本公开还提供了如本文所述的微生物(例如，根据上述实施方式中任一项的lab)，如本文所述的组合物，或如本文所述的药物组合物，用于治疗1型糖尿病(t1d)。
47、本公开还提供了如本文所述的微生物(例如，根据上述实施方式中任一项的lab)，如本文所述的组合物，或如本文所述的药物组合物，在制备药物中的用途，例如，用于治疗疾病，例如，自身免疫疾病，如1型糖尿病(t1d)。
48、方法1：治疗疾病的方法
49、本公开还提供了在有此需要的对象中治疗t1d的方法。示例性的方法包括向对象给予治疗有效量的如本文所公开的微生物(例如，lab)(例如，根据上述实施方式中任一项所述的lab)，如本文所公开的组合物或如本文所公开的药物组合物。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，对象是人，例如，人患者。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，该方法进一步包括向对象给予免疫调节剂(例如，抗-cd3抗体)。例如，使用共治疗方案向对象给予免疫调节剂(例如，抗-cd3抗体)，即，同时用另一免疫调节剂如抗-cd3抗体处理对象(例如，人)。因此，在该实例中，本公开提供了在有此需要的人对象中治疗t1d的方法。示例性的方法包括向人对象给予治疗有效量的如本文所公开的lab(例如，根据上述实施方式中任一项所述的lab)，如本文所公开的组合物或如本文所公开的药物组合物，其中，进一步给予人对象抗-cd3抗体(例如，同时用抗-cd3抗体处理)。
50、在一些实例中，抗-cd3抗体是单克隆抗体。在其他实例中，抗-cd3抗体是人源化单克隆抗体。在其他实例中，抗-cd3抗体是奥特力昔珠单抗(otelixizumab)或特普利珠单抗(teplizumab)。在一些实例中，当与lab作为组合疗法给予时，抗-cd3抗体以不同于单一疗法常用的剂量给予对象。用于组合疗法的抗-cd3的最佳剂量可以通过动物模型和临床试验确定。优选地，抗-cd3的剂量小于用抗-cd3抗体的有效单一疗法通常所需的剂量，即，亚治疗剂量。可以确定对单一疗法有效的剂量，通过参照动物模型和临床试验，和通过本领域技术人员的实践，并且可以是监管批准的剂量。在一些实例中，向进行用lab的组合疗法的对象给予这样剂量的抗-cd3，其比单一疗法中抗-cd3的标准剂量小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在其他实例中，组合疗法中给予的抗-cd3的剂量比单一疗法中抗-cd3的剂量少约10-100％、少约10-90％、少约10-70％、少约10-60％、少约10-50％、少约50-100％或少约20-50％。实验已经显示，48或64mg奥特力昔珠单抗的6个每日剂量在36个月可以足以抑制t细胞活性，治疗组比安慰剂对照保留多80％的β细胞功能。然而，这样的剂量与潜在的eb感染的再活化相关。3.1mg/天剂量进行8天并不保护β-细胞功能。因此，比48mg少至少10％的治疗(即，43mg)将会被认为是“亚治疗”。
51、在一些实施方式中，上述方法中的哺乳动物对象最近已被诊断患有t1d(即患有最近发生的t1d)。在根据这些实施方式的一些实例中，对象可能在给予微生物(例如，lab)之前的前12个月，前24个月或前36个月内已经诊断为患有t1d。
52、在根据方法1的实施方式中任一项的一些实例中，该方法进一步包括在对象，例如，对象的器官或血液中测量临床标志物(例如，免疫生物标志物)。例如，该方法可以进一步包括测量对象血液中的t1d相关抗体。在一些实例中，该方法可以进一步包括测量对象血液中的胰岛素自身抗体(iaa)。在一些实例中，对象血液中iaa的量指示t1d疾病进展，例如，对象是否可以被分类成具有最近发生的t1d，并且可以指示对象是否将有可能受益于治疗。因此，测量iaa可以发生在将微生物给予对象之前。在一些实例中，疾病发作时iaa阳性预测阳性治疗结果。然而，测量iaa还可以用于监测和测量治疗的结果，并且可以因此在治疗期间(例如，间隔的整个治疗期)以监测治疗效率或结果和/或在治疗期后，例如，以监测对象在治疗停止后是否保持治疗结果(例如，正常血糖)。在一些实例中，iaa阳性的下降指示阳性治疗结果。在其他实例中，方法进一步包括测量对象中的调节t细胞。调节t细胞包括treg17、tr1 th3、cd8+cd28-、qa-1限制性t cells、cd4+foxp3+cd25+和/或cd4+foxp3+cd25-t细胞。优选地，cd4+foxp3+cd25+和/或cd4+foxp3+cd25-t细胞。在其他实例中，方法进一步包括测量对象中的初始血液葡萄糖浓度(blood glucose)。在其他实例中，方法进一步包括测量对象中的c-肽水平。
53、在相关实施方式中，本发明是这样的方法，其增加treg细胞活性以抑制对β细胞和/或t1d相关抗原的自身免疫应答，优选地，抑制对所有t1d相关抗原的自身免疫应答。在其他实施方式中，本发明是这样的方法，其基本上减少，优选停止对β细胞和/或任何t1d相关抗原的自身免疫应答。优选地，自身免疫应答中的显著减少导致疾病进展的显著减少或停止。
54、在上述方法中任一项的一些实施方式中，口服给予对象微生物(例如，lab)。例如，微生物(例如，lab)以用于口服给予的药物组合物的形式(例如，胶囊、片剂、颗粒或液体)给予对象，其包含微生物(例如，lab)和药物学上可接受的运载体。在其他实例中，微生物(例如，lab)以食物产品的形式给予对象或添加到食物(例如，饮品)。在其他实例中，微生物(例如，lab)以膳食补充品的形式给予对象。在其他实例中，微生物(例如，lab)以栓剂产品的形式给予对象。在一些实例中，本公开的组合物适用于多肽的粘膜递送，其通过微生物(例如，lab)表达。例如，可以配制组合物用于在对象的胃肠道(例如，肠)中有效释放。
55、根据上述实施方式中任一项，本公开还提供了用于在有此需要取得对象中建立对t1d特异性抗原(例如，pins)耐受的方法。示例性的方法包括向对象给予治疗有效量的如本文所公开的微生物(例如，lab)(例如，根据上述实施方式中任一项所述的lab)，如本文所公开的组合物或如本文所公开的药物组合物。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，对象是人，例如，人患者。
56、根据上述实施方式中任一项，本公开还提供了用于在有此需要的对象中减少iaa的方法，或用于在有此需要的对象中增加cd4+foxp3+t细胞数量的方法。示例性的方法包括向对象给予治疗有效量的如本文所公开的微生物(例如，lab)(例如，根据上述实施方式中任一项所述的lab)，如本文所公开的组合物或如本文所公开的药物组合物。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，对象是人，例如，人患者。
57、在一些实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，减少给予(即必需给予)对象的胰岛素量以控制血液葡萄糖水平或维持特定血液葡萄糖水平(例如，如医师所推荐的，或通常认为是安全的)。例如，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，当与未给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体的对应对象所需胰岛素量相比时，或当与用抗-cd3抗体单独处理的对应对象所需胰岛素量相比时，减少控制对象中血液葡萄糖水平或维持特定血液葡萄糖水平所需的胰岛素的量。
58、在其他实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，在对象中保留β细胞功能(例如，保留在治疗开始测量的β细胞功能)在对象中例如使用本领域认可的方法测量。本文还描述了用于测量β细胞功能的示例性方法(例如，使用c-肽水平)。在一些实例中，对象中的β细胞功能在开始给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体后保留至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约10个月、至少约12个月、至少约14个月、至少约16个月、至少约18个月、至少约20个月、至少约22个月或至少约24个月。在其他实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，当与未给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体的对应对象中保留β细胞功能的时间相比时，或当与用抗-cd3抗体单独处理的对应对象相比时，增加对象中保留β细胞功能的时间。
59、在其他实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，在对象中维持正常的血糖，例如，使用本领域认可的方法测量。本文描述了与正常血糖关联的血液葡萄糖范围。例如，人对象中的正常血糖可以与两个126mg/dl或更少的连续快速血液葡萄糖测量关联。用于测量血液葡萄糖水平的示例性方法为本领域已知并且述于本文。在一些实例中，对象(经受治疗)中的正常血糖在开始给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体后保留至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约10个月、至少约12个月、至少约14个月、至少约16个月、至少约18个月、至少约20个月、至少约22个月或至少约24个月。在其他实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，当与未给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体的对应对象中维持正常血糖的时间相比时，或当与用抗-cd3抗体单独处理的对应对象中维持正常血糖相比时，增加对象中维持正常血糖的时间。
60、在其他实例中，向对象给予治疗有效量的本公开的微生物(例如，lab)和本公开的抗-cd3抗体(例如，根据上述方法中的任一项)，在对象中维持正常的血红蛋白a1c(hba1c)水平，例如，使用本领域认可的方法测量。在一些实例中，对象(经受治疗)中的正常hba1c水平在给予微生物(例如，lab)和抗-cd3抗体后维持至少约2个月、至少约4个月、至少约6个月、至少约8个月、至少约10个月、至少约12个月、至少约14个月、至少约16个月、至少约18个月、至少约20个月、至少约22个月或至少约24个月。
61、在另一实施方式中，本发明的治疗性方法减缓疾病，从而相较于未治疗的对象，使经治疗的对象的高血糖症的频率和程度降低。这类降低可以是未处理的对象的10、20、30、40、50、60、70、80或90％。
62、未处理的t1d随时间发育并且逐渐恶化，因为胰腺中的β细胞被破坏。因此，由于本文所述方法可以停止疾病，有利的是在疾病进展中尽可能早的治疗对象。疾病进程的这类标志物包括，但不限于，血糖指标，胰岛素自身抗体(iaa)水平、片段c水平和胰岛炎。因此，在一相关实施方式中，本发明的治疗性方法还包括在治疗前和治疗期间测量疾病的进展。
63、例如，当在对象中测量到下述中任一项时，可以将人对象分类成具有早期发生的t1d：(1)2次连续空腹血液葡萄糖测试等于或大于126mg/dl；(2)当任何随机血液葡萄糖测量大于200mg/dl时；(3)血红蛋白a1c(hba1c)测试等于或大于6.5％(hba1c是给予血液糖类3个月平均值的血液测试)；或(4)具有超过200mg/dl的任何值的2小时口服葡萄糖耐受测试，或其组合。因此，可以通过下述中任一项表征正常的血糖：(1)2次连续空腹血液葡萄糖测试低于126mg/dl，低于120mg/dl或低于100mg/dl；(2)当任何随机血液葡萄糖测量低于200mg/dl、低于180mg/dl、低于160mg/dl或低于140mg/dl时；(3)血红蛋白a1c(hba1c)测试小于6.5％或小于6％；或(4)具有低于200mg/dl、低于180mg/dl、低于160mg/dl或低于140mg/dl的值的2小时口服葡萄糖耐受测试，或其任何组合。
64、一旦疾病进展显著地下降(并且优选地中止，特别是对于是致病过程基础的自身免疫)，通过方法可以进一步处理对象以恢复β细胞功能。因此，在进一步的实施方式中，对象可以用β细胞移植物和/或用药物处理，以引起内源性β细胞的增殖。因为该方法能够逆转作为t1d基础的自身免疫，所以该方法并不限于早期发生的糖尿病。一旦清除了破坏β细胞的自身免疫，β细胞功能可以通过移植，和/或通过促进内源性β细胞的生长和发育恢复。因此，该方法可以适用于患有慢性糖尿病的对象。
65、在进一步的实施方式中，本发明的治疗性方法减缓疾病进展，从而使恶化的速率是未处理的疾病四分之三、一半、四分之一或更少。例如，这类恶化可以通过血糖指标、胰岛素自身抗体(iaa)水平、片段c水平和胰岛炎评估。
66、在进一步的实施方式中，给予本发明的治疗性方法以预防t1d，如在任何临床症状之前给予。优选地，鉴定对象具有t1d风险因子，包括家族史，血液和尿液中糖水平升高(但是并非糖尿病)和对t1d相关抗原的抗体，并且随着时间推移这些标记物逐渐恶化。
67、方法2：制备遗传修饰的生物体用于治疗t1d的方法
68、本公开提供了用于制备遗传修饰的微生物(例如，本文所公开的lab的方法。示例性的方法包括(i)将微生物(例如，lab)与编码il-10多肽的外源性核酸接触；和(ii)将微生物(例如，lab)与编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸接触，其中，编码il-10多肽的外源性核酸和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸经染色体整合(即，整合到微生物例如lab的染色体中)。当将核酸整合到微生物(例如，细菌)基因组中时，例如，染色体中，形成了遗传修饰的微生物(例如，lab)。进行当前方法遗传修饰的微生物(例如，lab)可以是任何微生物菌株，例如，可以是野生型细菌菌株，或者可以在其与编码il-10多肽的外源性核酸和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸接触前经遗传修饰。
69、在一些实例中，上述方法采用同源重组以整合核酸到微生物(例如，细菌)染色体中。因此，在一些实例中，根据这些实施方式，编码il-10多肽的外源性核酸和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸使用同源重组经染色体整合(例如，采用包含相应的核酸的一个或多个整合质粒)。在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，将微生物(例如，lab)与编码il-10多肽的外源性核酸(例如，包含编码il-10多肽的外源性核酸的整合质粒)接触发生在将lab与编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸(例如，包含编码pins多肽的外源性核酸的整合质粒)接触之前。在根据这些实施方式中任一项的其他实例中，将微生物(例如，lab)与编码il-10多肽的外源性核酸(例如，包含编码il-10多肽的外源性核酸的整合质粒)接触发生在将lab与编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸(例如，包含编码pins多肽的外源性核酸的整合质粒)接触之后。在根据这些实施方式中任一项的其他实例中，将微生物(例如，lab)同时接触编码il-10多肽的外源性核酸(例如，包含编码il-10多肽的外源性核酸的整合质粒)和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸(例如，包含编码pins多肽的外源性核酸的整合质粒)，或编码hil-10和pins两者的外源性核酸。
70、在根据这些实施方式中任一项的一些实例中，方法还包括将遗传修饰的微生物(例如，lab)的培养物与至少一种稳定剂(例如，冷冻保存剂)组合以形成微生物(例如，细菌)混合物。在一些实例中，方法进一步还包括从微生物(例如，细菌)混合物去除水，形成干燥的组合物。例如，方法可以进一步包括冻干微生物(例如，细菌)混合物以形成冷冻干燥的组合物。在其他实例中，方法可以进一步包括将遗传修饰的微生物(例如，lab)或干燥的组合物(例如，冷冻干燥的组合物)与药学上可接受的运载体组合以形成药物组合物。方法可以进一步包括配制干燥的组合物(例如，冷冻干燥的组合物)或药物组合物成药学剂量形式。
71、本本公开还提供了通过本文所述方法(例如，根据方法2的上述实施方式中任一项的方法)制备的遗传修饰的微生物(例如，遗传修饰的lab)。
72、方法3：制备药物组合物的方法
73、本公开还提供了用于制备药物组合物的方法。示例性的方法包括将如本文所公开的微生物(例如，lab)的培养物(例如，根据上述实施方式中任一项所述的lab)与至少一种稳定剂(例如，冷冻保存剂)接触，从而形成微生物(例如，细菌)混合物。在一些实例中，至少一种稳定剂包括至少一种冷冻保存剂。在一些实例中，微生物(例如，lab)包含编码白介素-10(il-10)多肽的外源性核酸，并且还包含编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸，其中，编码il-10多肽的外源性核酸和编码t1d特异性抗原(例如，pins)多肽的外源性核酸经染色体整合，即，整合到微生物(例如，细菌)染色体中(或位于其上)。
74、这类方法可以还包括从微生物(例如，细菌)混合物去除水，从而形成干燥的组合物。例如，方法可以包括冻干微生物(例如，细菌)混合物，从而形成冷冻干燥的组合物。
75、在根据方法3的上述实施方式中任一项的一些实例中，该方法还包括将干燥的组合物(例如，冷冻干燥的组合物)与药学上可接受的运载体接触形成药物组合物。方法可以还包括配制干燥的组合物(例如，冷冻干燥的组合物)成药学剂量形式，如片剂、胶囊或囊剂。
76、单位剂型
77、相应地，本公开还提供了单位剂型，其包含本公开的微生物(例如，lab)、本公开的干燥的组合物(例如，本公开的冷冻干燥的组合物)或本公开的药物组合物。在一些实例中，单位剂型是口服剂型，如片剂、胶囊(例如，含有粉末或含有微丸或微颗粒的胶囊)、颗粒或囊剂(例如，含有干细菌，用于悬浮于口服给药的液体中)。在一些实施方式中，剂型中含有的非病原性微生物(例如，lab)是干粉形式或其压缩的形式。
78、在根据这些实施方式的一些实例中，单位剂型包含约1×104至约1×1012菌落形成单位(cfu)的微生物(例如，lab)。在其他实例中，单位剂型包含约1×106至约1×1012菌落形成单位(cfu)的微生物(例如，lab)。在其他实例中，单位剂型包含约1×108至约1×1011cfu。在其他实例中，单位剂型包含约1×109至约1×1012cfu。
79、试剂盒
80、本公开还提供了试剂盒，其包含(1)根据本文所公开的实施方式中任一项的微生物(例如，lab)，包含根据本文所公开的实施方式中任一项的微生物(例如，lab)的组合物，包含根据本文所公开的实施方式中任一项的微生物(例如，lab)的药物组合物，或包含根据本文所公开的实施方式中任一项的微生物(例如，lab)的单位剂型；和(2)说明书，用于向哺乳动物例如人(例如，人患者)给予微生物(例如，lab)，组合物，药物组合物或单位剂型。
81、在相关实施方式中，试剂盒可以还包括用于确定疾病进展和成功治疗的测试(例如，针对血糖指标、胰岛素自身抗体(iaa)水平、片段c水平和胰岛炎的测试)。试剂盒还可以提供用于移植的β细胞。
1.一种乳酸菌(lab)，其包含编码人白介素-10(hil-10)的外源性核酸和编码人胰岛素原(hpins)的外源性核酸，其中所述编码hil-10的外源性核酸和编码hpins的外源性核酸经染色体整合。
2.如权利要求1所述的lab，其中，所述lab是乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。
3.如权利要求1所述的lab，其中，所述hil-10当以不存在信号肽的成熟hil-10分泌时，其在2位包含丙氨酸(ala)而非脯氨酸(pro)。
4.如权利要求1所述的lab，其中，所述hil-10具有与seq id no:1至少95％相同性的氨基酸序列，或者其中所述编码il-10的外源性核酸具有与seq id no:2至少95％相同性的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的lab，其中，所述编码hil-10的外源性核酸还编码与hil-10偶联的分泌序列，其中所述分泌序列是未鉴定的分泌的45-kda蛋白质(usp45)(ssusp45)。
6.如权利要求4所述的lab，其中，所述编码hil-10的外源性核酸位于hlla启动子(phlla)如乳酸乳球菌phlla的3’处。
7.如权利要求4所述的lab，其包含含有hlla启动子的表达盒，其转录偶联hil-10的ssusp45，其中所述表达盒在thya基因座处经染色体整合。
8.如权利要求1所述的lab，其中，所述hpins具有与seq id no:3至少95％相同性的氨基酸序列，或者其中所述编码hpins的外源性核酸具有与seq id no:4至少95％相同性的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的lab，其中，所述编码hpins的外源性核酸还编码与hpins偶联的分泌序列，其中所述分泌序列是未鉴定的分泌的45-kda蛋白质(usp45)(ssusp45)。
10.如权利要求8所述的lab，其中，所述编码hpins的外源性核酸包含第一多顺反子表达盒，其包含位于gapb基因5’处的gapb启动子，hpins分泌序列，和所述编码hpins的外源性核酸。
