本发明属于新型功能纳米材料、免疫分析和生物传感，涉及一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用。具体采用新型功能纳米材料构建免疫传感器用于乙肝抗原的检测。
背景技术：
1、乙肝病毒(hbv)是全世界范围内最常见的临床问题之一，能引起慢性肝炎，导致肝脏功能受损，肝硬化和肝癌。乙肝抗原hbe和乙肝抗原hbs是诊断hbv发生与感染的关键肿瘤标志物。通过检测乙肝抗原hbe和乙肝抗原hbs在体内的含量，能够监测治疗后hbv的复发并可评估治疗效果。因此，发展高灵敏并且简单的方法检测乙肝抗原hbe或乙肝抗原hbs有重要的实际意义。
2、本发明将具有高导电性，良好的生物兼容性，分散性和稳定性的金纳米作为性能优异的基底材料，用于固载乙肝抗原捕获抗体。二氧化锡氧化石墨烯具有较大的比表面积为铜镍纳米颗粒（cu8ni2）提供丰富的结合位点。由于二氧化锡镶嵌于石墨烯层之间使其具有单层结构，更容易负载高密度的cu8ni2，并且避免了发生团聚。cu8ni2具有良好的生物相容性和分散性，且不含贵金属成分，成本低廉，通过cu-n和ni-n有效结合乙肝抗体。金属铜和镍对过氧化氢分解都有很好催化活性和电化学性能，通过实验调整铜镍摩尔比，可改变电子效应和晶格结构，提高铜镍合金催化效率，当铜镍摩尔比为8:2时，催化活性最高。纳米尺寸的cu8ni2比表面积大，活性位点集中在表面，因此为催化过氧化氢提供了更大的催化表面积，微量的材料即可表现出很强催化能力，在电化学检测中可检测到更强电信号，进而提高电化学免疫传感器的灵敏度。
技术实现思路
1、本发明提供了一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，实现了对乙肝抗原的灵敏检测。
2、本发明的目的之一是提供一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法。
3、本发明的目的之二是将所制备的铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器，用于检测乙肝抗原。
4、为实现上述目的之一，本发明公开了一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
5、（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm al2o3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；
6、（2）上述玻碳电极浸泡入10 ml，1% haucl4溶液中，在-0.2 v电压下，电镀30 s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；
7、（3）将上述电极浸入5 ~ 15 µg/ml的乙肝抗原捕获抗体的溶液中，4 ℃孵化12 h，4 ℃冰箱中晾干；
8、（4）继续将2 ~ 4 µl、0.5 ~ 1.5 mg/ml的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，于4℃冰箱中孵化2 ~ 6 h，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；
9、（5）继续将上述电极浸入0.01 ~ 100 ng/ml的一系列不同浓度的乙肝抗原的溶液中，37℃孵化1 h，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中干燥；
10、（6）将上述电极浸入1 ~ 3 mg/ml的铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯标记的乙肝抗原检测抗体溶液中，37℃孵化1 h，超纯水冲洗电极表面，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器。
11、所述铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯溶液的具体制备步骤如下：
12、（1）将15mg二氧化锡石墨烯分散于30ml乙二醇中，超声处理8h，形成均匀分散的二氧化锡石墨烯溶液。将产物离心收集，分别用乙醇和超纯水洗涤三次。最后，将得到的溶液在真空烘箱(60°c, 4 h)中干燥，并用于以下实验。
13、（2）将0.5ml， 20 mmol/l的 cucl2和nicl2（cu/ni摩尔比为8:2）的乙二醇溶液与1.4 ml， 0.5 mg/ml二氧化锡石墨烯乙二醇溶液混合，搅拌10 min后，加入6 ml乙二醇溶液和0.2 ml，0.2 mol/l的氢氧化钠乙二醇溶液，再搅拌10分钟。
14、（3）将上述溶液置于油浴中180℃下反应15分钟，停止加热。待产品冷却至室温后，离心收集产品，用乙醇洗涤三次。产品在真空烘箱中60℃下干燥4 h后，收集铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯纳米复合材料。
15、进一步的，所述铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯标记的乙肝抗原检测抗体溶液的具体制备步骤如下：
16、取3 mg铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯分散于1 ml超纯水中，制得3 mg/ml铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯溶液，4℃下保存备用。
17、进一步的，所述乙肝抗原选自乙肝抗原hbs、乙肝抗原hbe之一。
18、为实现上述目的之二，本发明公开了铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的应用，在于将其用于乙肝抗原的检测。
19、具体的步骤如下：
20、（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 ml、50 mmol/l的ph 7.4磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
21、（2）电化学测量。-在ph = 6.81的pbs缓冲溶液中(检测电位为−0.4 v)，用安培i-t法记录电流信号响应，待背景电流达到稳定后，向pbs中注入10 μl h2o2 (5.0 m)
22、(10ml)，以一定的搅拌速度搅拌，并记录电流信号。
23、用计时电流法对分析物进行检测，检测电位为−0.4 v，待背景电流达到稳定后，向10 ml，ph = 7的pbs中注入10 μl，5mol/l的h2o2，记录不同浓度的乙肝抗原溶液所对应的响应电流信号强度；
24、（3）利用工作曲线法，得到待测样品中乙肝抗原的浓度。
25、本发明的有益成果
26、（1）本发明将具有高导电性，良好的生物兼容性，分散性和稳定性的金纳米作为性能优异的基底材料，用于固载乙肝抗原捕获抗体，为后续与乙肝抗原特异性结合提供良好基础，此外，其较高的导电性也有利于电流信号的灵敏检测；
27、（2）由于二氧化锡镶嵌于石墨烯层之间使其具有单层结构，更容易负载高密度的cu8ni2，并且避免了发生团聚。cu8ni2具有良好的生物相容性和分散性，且不含贵金属成分，成本低廉，通过cu-n和ni-n有效结合乙肝抗体。铜镍摩尔比为8:2时，催化活性最高，且纳米尺寸的cu8ni2比表面积大，活性位点集中在表面，因此为催化过氧化氢提供了更大的催化表面积，微量的材料即可表现出很强催化能力，在电化学检测中可检测到更强电信号，进而提高电化学免疫传感器的灵敏度；
28、（3）一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器用于对乙肝抗原的检测，其中对乙肝抗原hbs的检测，线性范围为0.01 ～ 100 ng/ml，检测限最低3.4pg/ml；对乙肝抗原hbe的检测，线性范围为0.01 ~ 100 ng/ml，检测限为3.6 pg/ml，表明一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器可以达到准确测定乙肝抗原的目的。
1.一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：
2.如权利要求1所述的一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，其特征在于：所述铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯溶液的具体制备步骤如下：
3.（2）将0.5ml， 20 mmol/l的 cucl2和nicl2（cu/ni摩尔比为8:2）的乙二醇溶液与1.4ml， 0.5 mg/ml二氧化锡石墨烯乙二醇溶液混合，搅拌10 min后，加入6 ml乙二醇溶液和0.2 ml，0.2 mol/l的氢氧化钠乙二醇溶液，再搅拌10分钟。（3）将上述溶液置于油浴中180℃下反应15分钟，停止加热。待产品冷却至室温后，离心收集产品，用乙醇洗涤三次。产品在真空烘箱中60℃下干燥4 h后，收集铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯纳米复合材料。
4.如权利要求1所述的一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，在于将其用于乙肝抗原的检测。具体的步骤如下：
5.用计时电流法对分析物进行检测，检测电位为−0.4 v，待背景电流达到稳定后，向10ml，ph = 7的pbs中注入10 μl，5mol/l的h2o2，记录不同浓度的乙肝抗原溶液所对应的响应电流信号强度；
6.如权利要求1-3任意一项所述的一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，其特征在于，所述乙肝抗原选自乙肝抗原hbs、乙肝抗原hbe。
7.如权利要求1-4任意一项所述的一种铜镍纳米合金负载二氧化锡石墨烯传感器的制备方法及应用，在于将其用于乙肝抗原的检测。
