本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种作为一氧化氮荧光探针使用的(e)-(4-((4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基)丁基)三苯基膦的制备方法与使用方法。
背景技术：
1、一氧化氮（nitric oxide，简称no）是生物系统中普遍存在的信使分子，主要在3种no合成酶（enos，nnos和inos）的催化作用下，通过内源性l-精氨酸转化为l-瓜氨酸而产生。它具有多样的生理功能，包括调节血管张力、抗血小板凝聚、神经传递等作用，同时积极参与免疫介导的病理过程。在心血管系统、免疫系统以及神经系统中发挥了重要生理功能。no的生理作用与其浓度高度相关，在浓度不足时，no对肿瘤的生长起到促进作用，且会导致血栓形成、免疫功能下降等问题；当no浓度过高时，会出现氧化应激、细胞损伤、血管及神经毒性等危害。因此，开发特异性检测人体内的no浓度的方法，对我们理解其生理和病理过程至关重要。
2、荧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对待测样品的实时、在线检测而受到研究者的广泛关注。
3、在过去十年中,已经开发了大量的荧光no探针,其中包括过渡金属复合物型和邻苯二胺型。基于过渡金属复合物的no荧光探针因生物兼容性差而很少应用于生物体中no的研究。基于邻苯二胺的no荧光探针最早开发且应用最为广泛,相应的响应机理是邻苯二胺与no在氧气存在的条件下反应形成苯并三唑衍生物,从而抑制了光诱导电子转移(pet)过程。然而邻苯二胺型荧光探针受dha/aa/mgo干扰同样引起荧光信号改变。近年来,又开发了许多新反应类型的no探针如邻苯二胺-罗丹明内酰胺型,单氨基型,形成se醚型,和基于汉斯酯的芳构化等类型,这些探针的开发改善了荧光探针，在一定程度上解决了生物兼容性和对no的选择性等问题。
4、然而，基于反应型的一氧化氮荧光探针（参见综述chenqian ye, shufang lin,jinyi li, peng meng, luqiang huang, daliang li, comprehensive insights intofluorescent probes for the determination nitric oxide for diseases diagnosis,bioorganic chemistry, 2024,150,107505），其中包括邻苯二胺类、汉斯酯类、氮亚硝化等各种方式检测no，而这些已报道探针仍存在荧光团稳定性差，合成困难，单波长检测致使检测易受到生物体自发荧光的干扰等缺陷，这将限制其在生物体内的应用。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提出了一种定量检测一氧化氮的比率型荧光探针（bnpph3）。利用本发明可对样品中的一氧化氮进行定量检测。
2、异佛尔酮作为一个优异的荧光母团具有其独特的d-π-a共轭体系，在光激发下会发生由电子给体向电子受体的分子内电荷转移过程，具有近红外区域的优良荧光发射、超快的分子内转移电荷转移(ict)引起的大斯托克斯位移，双光子吸收等优良的性能。因此，基于异佛尔酮荧光母团，构筑了经典的分子内电荷转移（ict）体系。因其具有的ict效应使得探针本身呈现红色荧光，但当存在一氧化氮的条件下，一氧化氮与探针分子上的胺基发生加成反应，进而抑制了分子的ict效应，使得探针分子发射出黄色荧光，通过上述方案，获得了“比率”型的荧光响应，实现了对一氧化氮的高灵敏、特异性检测。
3、本发明所述一氧化氮荧光探针命名为(e)-(4-((4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基)丁基)三苯基膦，结构式如式（i）所示：
4、上述荧光探针的制备方法如下：将一定量的(e)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈，(4-溴丁基)三苯基溴化膦，碘化钠和n,n-二异丙基乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在一定温度下反应一段时间。反应完全后，旋干经柱层析得到黑红色固体化合物(e)-(4-((4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基)丁基)三苯基膦即：bnpph3。
5、上述探针的制备反应式如下：
6、
7、作为优选，所述i）中(e)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈（1），(4-溴丁基)三苯基溴化膦（2），碘化钠（3）和n,n-二异丙基乙胺（4）的摩尔比为0.1~1：1：1：3.5，碘化钠与n,n-二甲基甲酰胺的物质的量与体积比为1:1~25；；反应温度为30~120度，反应时间为1~24小时。
8、作为优选，i）(e)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈（1），(4-溴丁基)三苯基溴化膦（2），碘化钠（3）和n,n-二异丙基乙胺（4）的摩尔比为1：1:1:3.5；碘化钠与n,n-二甲基甲酰胺的物质的量与体积比为1:5；；反应温度为120度，反应时间为5小时。
9、上述一氧化氮荧光探针的使用方法如下：
10、步骤1：向不同浓度一氧化氮溶液中加入相同浓度的式（i）所示化合物，配置至少5种不同一氧化氮含量的含有式（i）所示化合物的标准溶液；
11、所示标准溶液中式（i）所示化合物的浓度为10 μm；
12、所示标准溶液中一氧化氮的含量为10 nm ~100 μm；
13、步骤2：分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为402 nm，以一氧化氮浓度为横坐标，以i547和i656为纵坐标，建立标准曲线；
14、i547表示所述标准溶液在波长为547 nm处的荧光发射峰强度值；i656表示所述标准溶液在波长为656 nm处的荧光发射峰强度值；
15、步骤3：向待测样品中加入式（i）所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（i）所示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为402 nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准曲线计算得出待测样品的一氧化氮含量。
16、本发明具有如下特点：
17、1）本发明提供的荧光探针是黑红色固体粉末，具有良好的光学稳定性。
18、2）本发明提供的荧光探针，其溶液对一氧化氮的浓度敏感，随着一氧化氮的增加，荧光灯下观察到其水溶液的荧光由红色变为黄色。
19、3）本发明提供的荧光探针，其发射波长位于656 nm，加入一氧化氮后，547nm处出现新的发射峰，为“比率”型响应，能大大消除检测时检测条件差异对结果的影响，提高检测的灵敏度。
20、4）本发明提供的荧光探针对一氧化氮浓度呈线性关系，可用于一氧化氮精确测量。
21、本发明提供的基于异佛尔酮染料的“比率”型一氧化氮探针对一氧化氮溶液具有良好的响应，能够实现对样品内一氧化氮的灵敏定量检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
1.一种检测一氧化氮的荧光探针,其特征在于：其分子式为c41h41n3p+，简称bnpph3，结构式为式（i）；
2.根据权利要求1所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于，合成步骤如下：
3.根据权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于：
5.一种检测一氧化氮的荧光探针的使用方法；其特征在于：
