本技术涉及重组蛋白，尤其涉及mratg5重组蛋白及其制备方法与应用。
背景技术：
1、自噬(autophagy)是机体中一种高度保守的分解代谢途径，具有双层膜结构的自噬体包裹住需要被分解的分子物质与细胞成分，后携带至溶酶体中降解。自噬作为机体应对外界刺激的一种保护机制，在机体免疫调节过程中发挥重要作用。当外界的细菌或病毒等病原体入侵细胞后，会诱导激活细胞自噬，自噬体会将入侵的病原体包裹后与溶酶体结合将病原体清除。
2、自噬的发生离不开众多自噬相关蛋白(autophagy-related proteins,atgs)的复杂调控，在人体和哺乳动物的研究中发现，自噬基因在受到免疫刺激后可单独参与自噬也可相互协作形成蛋白复合物参与自噬。在沙门氏菌(salmonella)刺激人的sw-480细胞后，自噬基因lc3-ii的表达量显著上升，而抑制鞘脂从头合成可抑制atg16l1的膜募集，并抑制沙门氏菌诱导的自噬蛋白lc3-ii表达。鞘脂与自噬基因具有防御入侵病原体的作用。自噬相关蛋白atg10s通过促进自噬体的形成可使丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,hcv)亚基因组复制子的溶酶体降解并抑制hcv病毒粒子在人的huh-7.5细胞中的复制。家鸡(gallusdomesticus)atg5基因的抑制表达可改变鸡成纤维细胞df-1内的脂质代谢相关基因动态表达量。研究者通过rna干扰分别敲降atg3与atg5后可以降低感染了李斯特菌(listeriamonocytogenes)的黄粉虫的存活率，证明atg3和atg5自噬基因可能在清除l.monocytogenes的免疫过程中发挥作用。在水产养殖动物中研究者也相继发现自噬基因病原感染诱导的先天免疫及适应性免疫应答时参与重要的调控作用，例如：草鱼(ctenopharyngodon idella)atg5与atg12基因的表达量在草鱼呼肠孤病毒(grass carpreovirus,gcrv)刺激后显著降低，进一步的研究发现在hek-293t细胞中过表达atg5与atg12可诱导自噬，表明atg5与atg12通过自噬调控参与草鱼的抗病毒反应。青鱼(mylopharyngodonpiceus)中的atg16l1与干扰素基因刺激因子(stimulatorofinterferongenes，sting)相互作用，并抑制sting的寡聚化，负向调节sting介导的抗病毒反应。大黄鱼(larimichthys crocea)atg10可通过促进自噬小体的形成参与机体抗病毒免疫反应。凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)自噬相关基因atg13在聚肌苷酸-聚胞苷酸(polynosinlcacid—polycyttdylic acld，poly(i:c))及哈维氏弧菌(vibrio harveyi，v.harveyi)刺激后表达量显著上调，同时atg5和lc3(哺乳动物细胞中酵母细胞atg8的同源物)也可以共同参与白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，wssv)刺激后的免疫反应。此外，克氏原螯虾(procambarus clarkii)atg14通过抑制自噬体和溶酶体的融合来阻断自噬从而促进wssv在机体中的复制。
3、然而，在罗氏沼虾中自噬相关基因的表达及在机体中的功能研究尚不清晰。罗氏沼虾(macrobrachiumrosenbergii)又称淡水长臂大虾，是我国重要的淡水虾养殖品种之一，养殖产地主要分布在我国的广东省、江苏以及浙江地区。据联合国粮农组织(foodandagriculture organization ofthe unitednations，fao)统计中国罗氏沼虾养殖总产量占全球养殖总产量的50％以上。随着养殖规模的扩大，由细菌感染引发的传染性疾病日渐增多，尤其是由气单胞菌属引起的滴星病、黑鳃病等疾病造成罗氏沼虾大规模死亡，给罗氏沼虾产业造成严重经济损失。研究表明，细胞自噬在罗氏沼虾的抗菌免疫反应中发挥重要的调控作用，同时激活细胞自噬可以显著提升罗氏沼虾在病原感染后的存活率。
4、因此，亟需一种能够防治罗氏沼虾病害的药物。
技术实现思路
1、本技术提供了mratg5重组蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏一种能够防治罗氏沼虾病害的药物的技术问题。
2、为解决上述技术问题，本技术实施例提供了：一种mratg5重组蛋白，所述mratg5重组蛋白为mratg5-pet-32a(+)重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、再一方面，本技术实施例提供了一种如上所述mratg5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
4、获取罗氏沼虾的目标组织样本；提取所述目标组织样本中的目标rna，将所述目标rna反转录为目标cdna；
5、以所述目标cdna为模板，进行pcr扩增，获得重组表达载体；
6、提取所述重组表达载体的质粒，进行诱导处理、纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白。
7、作为本技术一些可选实施方式，所述以所述目标cdna为模板，进行pcr扩增，获得重组表达载体的步骤，包括：
8、以所述目标cdna为模板，进行基因特异性扩增处理，获得第一pcr产物；所述基因特异性扩增处理的条件为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min；
9、使用琼脂糖凝胶电泳检测和分离pcr产物，并将分离后的产物连接至pmd-18t载体，获得连接产物；连接条件为：16℃，2h；
10、将所述连接产物使用热激方法转化入dh5α感受态细胞，获得转化后的感受态细胞；转化条件为：先冰浴30min，再放置42℃水浴锅45s，再在冰上放置5min；
11、在所述转化后的感受态细胞中加入500μl无抗生素lb液体培养基并在37℃，200rpm条件下培养1h；再将200μl的培养产物涂布与带有氨苄抗性的lb固体培养基上37℃培养12h；
12、使用无菌接种环随机挑取所述lb固体培养基上的单菌落，并进行pcr扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离验证，获得atg5特异性引物；所述atg5特异性引物包括atg5-f和atg5-r；
13、基于所述atg5特异性引物，构建重组表达载体。
14、作为本技术一些可选实施方式，所述基于所述atg5特异性引物，构建重组表达载体的步骤，包括：
15、选择pet-32a(+)和pegfp-n1-gfp为mratg5的原核表达载体和真核表达载体；
16、基于所述atg5特异性引物，利用双酶切的方法将mratg5基因和表达载体相连，获得重组表达载体引物；所述重组表达载体引物为重组原核表达载体引物：atg5-bamh i-f和atg5-xho i-r。
17、基于所述重组表达载体引物，进行基因特异性扩增处理，获得第二pcr产物；所述基因特异性扩增处理的条件为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min；
18、将所述第二pcr产物连接转化至pmd 18-t载体中，涂布于具有相应抗性的lb固体培养基，37℃过夜培养后挑取单菌落扩培送测；
19、测序正确后，将保留的菌液扩培提取质粒，获得重组表达载体的质粒；
20、将所述具有酶切位点的mratg5基因引物与所述重组表达载体的质粒进行双酶切，获得酶切后的mratg5基因胶回收产物与酶切后的重组表达载体质粒；
21、将所述酶切后的mratg5基因胶回收产物与所述酶切后的重组表达载体质粒在16℃连接5h，后转化至感受态细胞中，在具有氨苄抗性的lb固体培养基中37℃过夜培养后，挑取单菌落进行测序分析；
22、测序正确后，获得mratg5-pet-32a(+)重组表达载体和mratg5-pegfp-n1重组表达载体。
23、作为本技术一些可选实施方式，所述提取所述重组表达载体的质粒，进行诱导处理、纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
24、提取mratg5-pet-32a(+)重组表达载体的质粒，转化至transetta(de3)感受态细胞中，扩大培养细菌，使菌液浓度达到对数生长期后，加入终浓度为1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在16℃，130rpm条件下诱导表达12h，获得诱导产物；
25、将所述诱导产物进行纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白。
26、作为本技术一些可选实施方式，所述将所述诱导产物进行纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
27、使用beyogoldtmhis-tag purification resin对所述诱导产物进行蛋白纯化；使用裂解液平衡ni柱后，将8倍柱体积的蛋白上清液上柱，回收蛋白穿流液重复上柱5次后，使用无咪唑wash buffer洗脱镍柱，再使用含有咪唑的wash buffer进行蛋白洗脱，获得纯化产物；
28、将所述纯化产物进行透析处理，获得mratg5目标重组蛋白。
29、作为本技术一些可选实施方式，所述将所述纯化产物进行透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
30、配置含有阶梯浓度尿素的蛋白复性透析液；所述含有阶梯浓度尿素的蛋白复性透析液包括含有浓度为0m、1m、2m、3m、4m和6m的尿素，ph＝7.4-8.0的蛋白复性透析液；
31、将所述纯化产物放入所述含有阶梯浓度尿素的蛋白复性透析液中，按照尿素浓度从高到低的顺序置于4℃条件下进行蛋白透析复性，每12h更换透析液；
32、透析完成后，获得mratg5目标重组蛋白。
33、作为本技术一些可选实施方式，所述获取目标组织样本；提取所述目标组织样本中的目标rna，将所述目标rna反转录为目标cdna的步骤，包括：
34、将罗氏沼虾的离体组织样本与等量的抗凝剂混合后，进行离心处理，离心处理结束后将上清液去除放入液氮中研磨成粉末；
35、提取所述目标组织样本中的目标rna，将所述目标rna反转录为目标cdna。
36、再一方面，本技术实施例提供了一种如上所述mratg5重组蛋白的应用，用于制备防治罗氏沼虾病害的药物。
37、作为本技术一些可选实施方式，当所述mratg5重组蛋白用于制备防治罗氏沼虾病害的药物时，其防治机制是：抑制a.hydrophila细菌和c.freundii细菌在机体内的增殖，以增强罗氏沼虾的抗菌免疫能力。
38、本技术克隆并鉴定了罗氏沼虾mratg5基因，通过构建mratg5-pet-32a(+)原核表达载体，成功诱导和纯化出mratg5的重组表达活性蛋白，并分析了其对细菌的结合和抑菌活性。并基于实验结果表明，mratg5可以通过与细菌的结合抑制病原菌在机体中的增殖从而增强罗氏沼虾的抗菌免疫能力。本技术的结果将为深入研究罗氏沼虾免疫防御功能提供数据支撑，并为罗氏沼虾病害防治提供一定理论基础。
1.一种mratg5重组蛋白，其特征在于，所述mratg5重组蛋白为mratg5-pet-32a(+)重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.一种如权利要求1所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述以所述目标cdna为模板，进行pcr扩增，获得重组表达载体的步骤，包括：
4.根据权利要求3所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于所述atg5特异性引物，构建重组表达载体的步骤，包括：
5.根据权利要求4所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述提取所述重组表达载体的质粒，进行诱导处理、纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
6.根据权利要求5所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述诱导产物进行纯化处理和透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
7.根据权利要求6所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述纯化产物进行透析处理，获得mratg5目标重组蛋白的步骤，包括：
8.根据权利要求2所述mratg5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述获取目标组织样本；提取所述目标组织样本中的目标rna，将所述目标rna反转录为目标cdna的步骤，包括：
9.一种如权利要求1所述mratg5重组蛋白的应用，其特征在于，用于制备防治罗氏沼虾病害的药物。
10.根据权利要求9所述mratg5重组蛋白的应用，其特征在于，当所述mratg5重组蛋白用于制备防治罗氏沼虾病害的药物时，其防治机制是：抑制嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌在机体内的增殖，以增强罗氏沼虾的抗菌免疫能力。
