本发明涉及生物和肿瘤治疗领域。具体地，本发明涉及一种用于抑制实体瘤生长和减轻免疫抑制的重组溶瘤腺病毒载体的制备方法和应用。
背景技术：
1、随着对恶性肿瘤发病机制的深入认识和治疗技术的不断发展，肿瘤干细胞相关治疗、肿瘤免疫治疗和肿瘤基因治疗等新技术逐步成为了治疗恶性肿瘤的新方向。
2、基因治疗药物由于可以降低治疗频次、减小药物负担，已经成为近年来恶性肿瘤治疗药物的重点研究方向。其中，溶瘤病毒(oncolytic viruses,ovs)是一种受关注的类型。自2015年fda批准t-vec,imlygic(talimogene laherparepvec,imlygic)溶瘤病毒疗法上市以来，这一新兴疗法迅速表现出了优秀的未来潜力和治疗价值。通常它们可以选择性地复制，通过直接裂解肿瘤细胞，并通过释放肿瘤特异性抗原招募抗原特异性t细胞，而杀死肿瘤细胞，且不伤害正常组织。溶瘤病毒可以是天然野生型或转基因病毒，但后者能够通过基因工程化而具备更多特性并降低副作用，例如实现肿瘤选择性复制。但是，作为限制免疫应答的反调控措施，溶瘤病毒杀死免疫原性细胞后，会释放局部细胞因子，增加t细胞上pd-1的表达和肿瘤细胞上pd-l1的表达。此外，由于物理屏障、肿瘤的异质性以及免疫抑制，溶瘤病毒治疗对实体肿瘤的疗效依旧有限。
3、pd-l1(programmed death ligand 1，程序性死亡配体1)是一种免疫检查点蛋白，通过与其受体即pd-1(programmed cell death protein 1，程序性死亡蛋白1)结合而调节免疫反应。pd-l1与免疫细胞上的pd-1的相互作用会抑制t细胞活性和增殖，诱导活化的t细胞凋亡，这种效应能够帮助肿瘤细胞逃逸免疫系统的识别和杀伤。因此，削弱pd-1/pd-l1相互作用已成为一种有效的治疗策略，以增强多种恶性肿瘤的抗肿瘤免疫应答。但在进行了临床批准的pd-1/pd-l1抑制剂治疗后，许多肿瘤仍然响应不佳甚至最终进展，这提示关于pd-l1在癌症中的功能还需要更多的了解。
4、在本领域此前的尝试中，多数溶瘤病毒不能在整个肿瘤块内有效扩散，从而降低了治疗效果。而这种现象主要是由于肿瘤区域内受损血管的功能异常导致间质液压力升高。研究表明，抗血管生成药物，例如血管内皮生长因子(vegf)拮抗剂/抑制剂进行抗血管生成治疗，对于异常血管新生的抑制即血管正常化的能力可以显著改善这一现状，是在促血管生成和抗血管生成之间保持平衡，显著改善溶瘤病毒的分布。同时，溶瘤病毒的递送可能会导致肿瘤细胞形成的异常血管损坏从而进一步导致肿瘤内血液灌注减少以及肿瘤缺氧增加，因此将溶瘤病毒和抗血管生成药物联合使用可能会增强病毒递送以及增强免疫细胞的募集，进而改善实体肿瘤的治疗效果。
技术实现思路
0、发明概述
1、在第一方面，本发明提供了一种重组溶瘤病毒载体，其中所述重组溶瘤病毒载体携带双转基因，即第一外源基因和第二外源基因，其表达产物分别是功能性地靶向肿瘤环境中的vegf和pd-l1的抑制剂，因而所述重组溶瘤病毒载体能够抑制肿瘤(优选地，实体瘤)组织局部的异常新生血管的生成，并下调肿瘤(优选地，实体瘤)细胞表面免疫检查点分子pd-l1的表达，从而抑制肿瘤生长并增强肿瘤特异性免疫应答对肿瘤细胞的杀伤作用，促进肿瘤的溶解。
2、在一些优选的实施方案中，所述重组溶瘤病毒载体是复制型。
3、在一些实施方案中，所述重组溶瘤病毒载体是腺病毒。
4、在一些实施方案中，所述第一外源基因的表达产物是功能性vegf抑制剂。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是靶向vegf的抑制性结合蛋白。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是靶向vegf的抑制性抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是靶向vegfr的抑制性结合蛋白。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是靶向vegfr的抑制性抗体或其抗原结合片段。
5、在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是阿柏西普或康柏西普。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是贝伐珠单抗，雷珠单抗或溴珠单抗。在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是雷莫芦单抗。在一些最优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是抗vegf抗体，例如，贝伐珠单抗。
6、在一些优选的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂是包含重链和轻链的抗体，其中所述重链是：(i)如seq id no:20所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:20具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列；或(iii)在seq id no:20的基础上存在不多于10个氨基酸的取代、缺失和/或添加且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列；其中所述轻链是：(i)如seq id no:21所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:21具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列；或(iii)在seq id no:21的基础上存在不多于10个氨基酸的取代、缺失和/或添加且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列，任选地重链和轻链之间存在连接子。在一些更具体的实施方案中，所述连接子是自剪切多肽(例如，自剪切多肽t2a)或柔性连接子(例如，(ggggs)n，其中n是1、2、3、4或5)。
7、根据本发明一些更具体的实施方案，在第一外源基因中重链编码区位于轻链编码区上游。根据本发明的另一些更具体的实施方案，在第一外源基因中轻链编码区位于重链编码区上游。
8、在本发明的一些实施方案中，从所述第一外源基因首先表达前述功能性vegf抑制剂的前体，优选地，包含信号肽的前体；更优选地，包含信号肽的重链多肽前体和包含信号肽的轻链多肽前体。
9、在一些具体的实施方案中，所述功能性vegf抑制剂前体包含：(i)如seq id no:5所示的氨基酸序列；(ii)与seq id no:5具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列；或(iii)在seq id no:5的基础上存在不多于10个氨基酸的取代、缺失和/或添加，且保留与vegf的特异性亲和力的氨基酸序列。
10、在一些优选的实施方案中，所述第一外源基因编码包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的蛋白，例如具有如seq id no:4所示的核酸序列，或具有由于遗传密码子简并性而不同于seq id no:4但与之编码相同氨基酸序列的核酸序列。
11、在一些优选的实施方案中，所述第二外源基因的表达产物是靶向pd-l1的shrna(即，shpd-l1)。在一些更优选的实施方案中，所述第二外源基因包含如seq id no:8-10任一项所示的核酸序列。
12、在一些最具体的实施方案中，所述第一外源基因由如seq id no:4所示的核酸序列组成，和/或所述第二外源基因由如seq id no:8所示的核酸序列组成。
13、在一些优选的实施方案中，所述重组溶瘤病毒载体包含一个或多个启动子，用于调控外源基因和/或病毒结构基因的表达。在一些更优选的实施方案中，所述一个或多个启动子中的至少一个启动子是肿瘤特异性启动子。
14、在一些优选的实施方案中，所述重组溶瘤病毒载体还包含调控序列，例如polya信号序列。在一些优选的实施方案中，所述重组溶瘤病毒载体在各个元件之间还包含连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点、同源重组位点(例如同源臂序列、loxp位点等)、或其任何组合。例如，由于所需的克隆操作，所述重组溶瘤病毒载体可以进一步包含5’和/或3’同源臂序列。
15、因此，在第一方面，本发明提供了一种重组病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
16、(a)第一启动子；
17、(b)第一外源基因，其表达功能性vegf抑制剂；
18、(c)可选的第一组调控序列；
19、(d)第二启动子；
20、(e)第二外源基因，其表达靶向pd-l1的shrna；
21、(f)可选的第二组调控序列。
22、在一些优选的实施方案中，所述第二外源基因包含如seq id no:8-10任一项所示的核酸序列；在一些最优选的实施方案中，所述第二外源基因由如seq id no:8所示的核酸序列组成。
23、因此，本发明还提供了一种重组病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
24、(a)第一启动子；
25、(b)第一外源基因，其表达功能性vegf抑制剂；
26、(c)可选的第一组调控序列；
27、(d)第二启动子；
28、(e)第二外源基因，其包含如seq id no:8-10任一项所示的核酸序列；
29、(f)可选的第二组调控序列。
30、在一些优选的实施方案中，所述第一启动子选自cmv启动子、ef-1α启动子、cox-2启动子、survivin启动子和htert启动子；在一些更优选的实施方案中，所述第一启动子是htert启动子。
31、在一些优选的实施方案中，所述第一外源基因编码包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的蛋白；在一些优选的实施方案中，所述第一外源基因包含如seq id no:4所示的核酸序列，或包含由于遗传密码子简并性而不同于seq id no:4但与之编码相同氨基酸序列的核酸序列；在一些最优选的实施方案中，所述第一外源基因由如seq id no:4所示的核酸序列组成。
32、在一些优选的实施方案中，所述第一组调控序列包含polya信号序列。
33、在一些优选的实施方案中，所述第二启动子是u6启动子。
34、在一些优选的实施方案中，所述第二组调控序列包含polya信号序列。
35、在一些优选的实施方案中，所述重组病毒载体是腺病毒，并且在元件(a)和(b)之间进一步包含元件(g)腺病毒e1a基因，任选地元件(g)和(b)之间通过自剪切多肽t2a的编码序列相连接。
36、在一些优选的实施方案中，所述重组病毒载体还包含连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点、同源重组位点(例如同源臂序列、loxp位点等)、或其任何组合。
37、在一些优选的实施方案中，本发明还提供了一种重组病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
38、(a)第一启动子，其选自cmv启动子、ef-1α启动子、cox-2启动子、survivin启动子和htert启动子；
39、(g)腺病毒e1a基因；
40、(b)表达功能性vegf抑制剂的第一外源基因；
41、(c)sv40 polya信号序列；
42、(d)u6启动子；
43、(e)第二外源基因；
44、(f)sv40 polya信号序列；和
45、(h)lo×p位点；
46、其中，任何相邻两个元件之间任选地通过连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点或其任何组合连接。
47、在一个具体实施方案中，本发明的重组病毒载体在基因组两端包含itr序列。
48、在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体是腺病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
49、(a)htert启动子；
50、(g)腺病毒e1a基因；
51、(b)第一外源基因，其表达功能性vegf抑制剂；
52、(c)sv40 polya信号序列；
53、(d)u6启动子；
54、(e)第二外源基因，其表达靶向pd-l1的shrna；
55、(f)sv40 polya信号序列；
56、其中，任何相邻两个元件之间任选地通过连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点或其任何组合连接。
57、任选地，所述载体进一步包含(h)loxp位点，位于(f)的3’侧(即，下游)。
58、在一个更具体的实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体是腺病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
59、(a)htert启动子；
60、(g)腺病毒e1a基因；
61、(b)第一外源基因，其编码包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的蛋白；
62、(c)sv40 polya信号序列；
63、(d)u6启动子；
64、(e)第二外源基因，其包含如seq id no:8-10任一项所示的核酸序列；
65、(f)sv40 polya信号序列；
66、其中，任何相邻两个元件之间任选地通过连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点或其任何组合连接。
67、任选地，所述载体进一步包含(h)loxp位点，位于(f)的3’侧。
68、在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体是腺病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
69、(i)5’itr，其序列是如seq id no:1所示或与seq id no:1具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
70、(a)htert启动子，其序列是如seq id no:3所示或与seq id no:3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
71、(g)腺病毒e1a基因，其序列是如seq id no:2所示或与seq id no:2具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
72、(b)第一外源基因，其序列是如seq id no:4所示的序列或由于遗传密码子简并性而不同于seq id no:4但与之编码相同氨基酸序列的核酸序列；
73、(c)sv40 polya信号序列，其序列是如seq id no:6所示或与seq id no:6具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
74、(d)u6启动子，其序列是如seq id no:7所示或与seq id no:7具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
75、(e)第二外源基因，其由如seq id no:8-10任一项所示的核酸序列组成；
76、(f)sv40 polya信号序列，其序列是如seq id no:6所示或与seq id no:6具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
77、(h)loxp位点，其序列是如seq id no:11所示或与seq id no:11具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；和
78、(j)3’itr，其序列是如seq id no:12所示或与seq id no:12具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列；
79、其中，任何相邻两个元件之间任选地通过连接子(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点或其任何组合相连接，并且其中，元件(g)和(b)之间通过自剪切多肽t2a的编码序列相连接。
80、在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含如seq id no:15所示的序列。
81、在第二方面，本发明提供了一种重组溶瘤病毒载体的制备方法，其中所述重组溶瘤病毒载体是本发明的重组溶瘤病毒载体，包括以下步骤：
82、(1)获得第一启动子片段、第一外源基因片段、第二启动子片段和第二外源基因片段，其中第一外源基因和第二外源基因的表达产物分别是功能性vegf抑制剂和靶向pd-l1的shrna(即，shpd-l1)；任选地，获得腺病毒结构基因e1a片段；
83、(2)将第一启动子片段、任选的e1a基因片段、第一外源基因片段、第二启动子片段、第二外源基因片段按5’至3’的方向插入穿梭质粒；然后
84、(3)将穿梭质粒与骨架质粒共转染包装细胞，并产生携带双转基因的重组溶瘤病毒载体。
85、在一个更具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
86、(1)通过基因合成获得插入片段，所述插入片段从5’至3’方向包含第一启动子片段、腺病毒结构基因e1a片段、第一外源基因片段、第二启动子片段和第二外源基因片段，其中第一外源基因和第二外源基因的表达产物分别是功能性vegf抑制剂和靶向pd-l1的shrna(即，shpd-l1)；
87、(2)将插入片段插入穿梭质粒；然后
88、(3)将穿梭质粒与骨架质粒共转染包装细胞，并产生携带双转基因的重组溶瘤病毒载体。
89、在一些优选的实施方案中，所述第一启动子是肿瘤特异性启动子。
90、在一些优选的实施方案中，所述方法还包括在第一和/或第二外源基因3’末端合成或连接调控序列，例如polya信号序列。在一些优选的实施方案中，所述方法还包括在元件的一端或两端进一步合成或连接连接子序列(例如自剪切多肽t2a的编码序列)、过渡序列、酶切位点、同源重组位点、或其任何组合。
91、在第三方面，本发明提供了一种用于治疗肿瘤(例如，实体瘤)的药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的重组病毒载体。通过瘤内局部注射或静脉注射本发明的所述药物组合物，能够抑制肿瘤(优选地，实体瘤)组织局部的异常新生血管的生成，并下调肿瘤(优选地，实体瘤)细胞表面免疫检查点分子pd-l1的表达，从而抑制肿瘤生长并增强肿瘤特异性免疫应答对肿瘤细胞的杀伤作用，促进肿瘤的溶解。
92、在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些优选的实施方案中，所述肿瘤是胃癌，肝癌，结直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，膀胱癌，乳腺癌、宫颈癌和脑胶质瘤。
93、在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含另外一种或另外多种有效的肿瘤治疗剂。
94、在第四方面，本发明提供了本发明的重组病毒载体的用途，用于制备治疗肿瘤(例如，实体瘤)的药物。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌，肝癌，结直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，膀胱癌，乳腺癌、宫颈癌和脑胶质瘤。
95、在一些实施方案中，本发明的治疗药物的给药方式为局部注射或静脉注射。
96、在一些实施方案中，本发明进一步提供了本发明的重组病毒载体的用途，用于与另外一种或另外多种有效的肿瘤治疗剂联合制备治疗肿瘤(例如，实体瘤)的药物。
97、因而，在本发明进一步的方面，本发明提供了一种治疗肿瘤(例如，实体瘤)的方法，所述方法包括将本发明的重组病毒载体，或本发明的药物组合物，施用于有需要的受试者(例如，肿瘤患者，例如，实体瘤患者)。在一些优选的实施方案中，所述肿瘤选自胃癌，肝癌，结直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，膀胱癌，乳腺癌、宫颈癌和脑胶质瘤。在一些实施方案中，所述施用是通过局部注射或静脉注射。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述受试者接受另外一种或另外多种抗肿瘤疗法，例如但不限于，手术治疗，化疗，放射治疗，靶向治疗，免疫治疗等等本领域已知的治疗手段。
98、在一些优选的实施方案中，本发明的病毒载体在给药进入体内后，能够在肿瘤细胞内稳定而持续地复制，表达其携带的外源基因，合成并分泌抗血管新生的vegf抑制剂，持续敲减肿瘤内pd-l1蛋白的表达，并且产生子代病毒感染其他肿瘤细胞，但本发明的病毒载体几乎不在非肿瘤细胞内表达和复制。
1.一种重组溶瘤病毒载体，其包含第一外源基因和第二外源基因，所述第一外源基因和第二外源基因表达产物分别是功能性vegf抑制剂和靶向pd-l1的shrna(即，shpd-l1)，并且包含一个或多个启动子，其中，所述功能性vegf抑制剂选自至少一个靶向vegf的抑制性结合蛋白、靶向vegf的抑制性抗体或其部分片段、靶向vegfr的抑制性结合蛋白和靶向vegfr的抑制性抗体或其部分片段。
2.如权利要求1所述的重组溶瘤病毒载体，其特征在于，所述功能性vegf抑制剂选自：
3.如权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒载体，其是复制型腺病毒，包含至少一个腺病毒复制所需的结构基因，优选e1a，
4.如权利要求1或2所述的重组溶瘤病毒载体，其基因组内从5’至3’方向包含以下元件：
5.一种重组溶瘤病毒载体的制备方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体，包括以下步骤：
6.重组溶瘤病毒载体，其特征在于，根据权利要求5的方法所制备获得，任选地所述重组溶瘤病毒载体经过纯化，优选地通过氯化铯密度梯度离心纯化。
7.权利要求1-4和6中任一项的重组溶瘤病毒载体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物用于局部注射和/或静脉注射。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是实体瘤，优选胃癌，肝癌，结直肠癌，肾细胞癌，胰腺癌，膀胱癌，乳腺癌、宫颈癌和脑胶质瘤。
10.药物组合物，其包含有(a)权利要求1-8和12-15任一项的重组溶瘤病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂，任选地，还包含其他肿瘤治疗剂。
