本发明涉及生物医药，尤其涉及一种呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体及其应用。
背景技术：
1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，以下简称rsv)广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿、老年人和免疫力低下的成年人急性下呼吸道感染(acute lowerrespiratory illness,alri)的重要病毒病原，目前中国国内尚无有效的rsv预防性疫苗获批上市，世界卫生组织将rsv疫苗列为当前应优先发展的疫苗之一。
2、rsv基因组为长约15.2kb的单股负链rna，编码11种蛋白，其中包括3种跨膜包膜糖蛋白(f、g和小疏水蛋白sh)，rsv感染主要由糖蛋白f和g介导，虽然f蛋白与g蛋白均处在病毒包膜外，均具有多个特异性抗原决定簇，但不同亚型间f序列高度保守，以f蛋白作为抗原的疫苗有望激发机体产生更广谱的保护力，因此使得f蛋白成为rsv疫苗的重要候选抗原。
3、在介导病毒包膜与宿主细胞膜融合期间，f蛋白从亚稳定的融合前构象转变为稳定的融合后构象。研究表明识别融合前构象特有抗原表位的抗体具有更有效的病毒中和活性，且大量的临床前及临床数据表明，以融合前构象rsv f为抗原的疫苗能够刺激机体产生更高水平的病毒中和抗体(griffin,m.r.(2022)."a challenge to respiratorysyncytial virus illness in adults."n engl j med 386(25):2427-2428.)。但是融合前构象f蛋白经物理或化学应激或储存后容易转变为融合后构象(mclellan,j.s.,et al.(2013)."structure-based design of a fusion glycoprotein vaccine forrespiratory syncytial virus."science 342(6158):592-598.)，因此将融合前f蛋白制备为能够长期稳定保存的疫苗抗原非常具有挑战。
4、以美国国立卫生卫生研究院、葛兰素史克、辉瑞和强生为代表的国际研究机构或疫苗厂商在rsv f蛋白的序列设计上已开展大量工作，美国国立卫生研究院已有1篇相关授权专利(授权公告号：cn105473604b)，强生已有3篇相关授权专利(授权公告号：cn105188745b、cn105408348b和cn107847581b)，在这些专利的基础上，葛兰素史克和辉瑞的疫苗经过十年的努力，终于在2023年3月获得美国fda上市批准，但目前国内相关疫苗的研发水平相对薄弱，尚未有同类产品上市。
技术实现思路
1、为了解决所述rsv f蛋白存在的稳定性不理想及表达量普遍较低的技术难题，本发明是在设计筛选了330余种rsv f蛋白突变体的基础上，确认了14个位点的取代类氨基酸突变、1类缺失类氨基酸突变、1类插入类氨基酸突变，增加了融合前rsv f蛋白的表达量和稳定性。本发明提供了融合前构象的rsv f重组蛋白突变体，所述rsv f蛋白突变体与野生型f蛋白相比，能够形成三聚体结构并维持在较稳定的融合前体状态，在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量大幅提高，蛋白质稳定性表现优异。其作为疫苗或者疫苗组分使用时免疫原性增强，能够诱导受免疫动物产生较高的中和抗体水平。本技术所述的rsv f蛋白突变体可用于预防和/或治疗rsv感染，也可以用做呼吸道合胞病毒的检测用试剂。所述突变体用作预防和/或治疗rsv感染时可以单独使用，可以与不同佐剂形成疫苗组合物使用，亦可以与不同类型疫苗产品形成多联疫苗使用。
2、本发明的第一个目的是提供了一种呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，所述突变体是将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中含菲林蛋白酶切位点的片段删除。
3、在本发明中，删除含菲林蛋白酶切位点的片段，能够避免野生型rsv f蛋白中菲林蛋白酶切导致的断裂，进而维持f蛋白融合前体构象。本发明中未引入任何菲林蛋白酶切位点的定点突变，同时无需引入异源连接序列，与野生型序列相比能维持更高的序列相似度。
4、进一步地，所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述突变体是将氨基酸序列中第100位与第147位之间28～46个氨基酸删除。
5、进一步地，所述突变体是将氨基酸序列中第105位与第143位之间37个氨基酸删除(位置105与143间37个氨基酸的缺失)。
6、进一步地，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白从融合前体向融合后体构象转化过程中发生阿尔法螺旋贯通的氨基酸突变为脯氨酸，或任意插入一个或多个脯氨酸，以阻断呼吸道合胞病毒融合f蛋白从融合前体向融合后体发生构象变化，使呼吸道合胞病毒融合f蛋白稳定在融合前体状态。
7、进一步地，所述突变体是进行如下至少一种突变：
8、将第210位谷氨酰胺突变为脯氨酸(q210p)；
9、将第211位丝氨酸突变为脯氨酸(s211p)；
10、将第213位丝氨酸突变为脯氨酸(s213p)；
11、将第214位异亮氨酸突变为脯氨酸(i214p)；
12、将第217位异亮氨酸突变为脯氨酸(i217p)；
13、在第210位与第217位氨基酸之间插入一个或多个脯氨酸。
14、进一步地，所述突变体是在第215位与第216位氨基酸之间插入一个脯氨酸(s215insertp)。
15、进一步地，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中的一个或多个带电氨基酸突变为极性氨基酸、疏水氨基酸或芳香氨基酸，以释放呼吸道合胞病毒融合f蛋白中的静电斥力，增强呼吸道合胞病毒融合f蛋白融合前体的稳定性。
16、进一步地，所述突变体是进行如下至少一种突变：
17、将第60位谷氨酸突变为丙氨酸(e60a)、甘氨酸(e60g)、丝氨酸(e60s)、苏氨酸(e60t)、亮氨酸(e60l)、蛋氨酸(e60m)或苯丙氨酸(e60f)；
18、将第194位天冬氨酸突变为丙氨酸(d194a)、甘氨酸(d194g)、丝氨酸(d194s)、苏氨酸(d194t)、亮氨酸(d194l)、蛋氨酸(d194m)或苯丙氨酸(d194f)；
19、将第486位天冬氨酸突变为甘氨酸(d486g)、苯丙氨酸(d486f)或半胱氨酸(d486c)；
20、将第489位天冬氨酸突变为甘氨酸(d489g)、苯丙氨酸(d489f)或半胱氨酸(d489c)。
21、在本发明中，将486位和489位天冬氨酸突变为半胱氨酸时，能在释放斥力的同时形成链间二硫键进一步提升三聚体稳定性。
22、进一步地，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中的一个或多个小体积氨基酸突变为较大体积疏水氨基酸，以填充融合前体构象的呼吸道合胞病毒融合f蛋白的表面空穴，增强呼吸道合胞病毒融合f蛋白融合前体的稳定性。
23、进一步地，所述突变体是将第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸(d67f)。
24、进一步地，所述突变体还包括将第509位丝氨酸突变为天冬氨酸(s509d)。
25、进一步地，所述突变体还包括将第512位亮氨酸突变为谷氨酰胺(s512q)、天冬酰胺(s512n)或苯丙氨酸(s512f)。
26、在本发明中，s509位和l512位氨基酸的突变，能够增加三聚体间的相互作用进而维持三聚体的稳定性。
27、进一步地，所述突变体还包括将第74位丙氨酸和第218位谷氨酸突变为半胱氨酸(a74c，e218c)。
28、在本发明中，将第74位丙氨酸和第218位谷氨酸突变为半胱氨酸以形成二硫键，可增加三聚体稳定性。
29、本发明的第二个目的是提供一种编码所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体的核酸分子。
30、进一步地，已经将该核酸分子进行密码子优化以用于在哺乳动物细胞中表达。
31、本发明的第三个目的是提供一种载体，所述载体包含所述核酸分子。
32、本发明的第四个目的是提供一种细胞，所述细胞表达所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，或包含所述核酸分子，或包含所述载体。
33、本发明的第五个目的是提供一种疫苗，所述疫苗包含所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体。
34、进一步地，所述疫苗还包含其他活性成分。
35、进一步地，所述疫苗还包含疫苗佐剂。
36、本发明的第六个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体、所述疫苗、所述核酸分子或所述载体。
37、进一步地，所述药物组合物中包括药学上可接受的辅料。
38、进一步地，所述药学上可接受的辅料包括保护剂、稳定剂、防腐剂、杀菌剂、灭活剂、佐剂和/或缓冲剂。
39、本发明的第七个目的是提供所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述疫苗或所述药物组合物在制备检测、预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
40、借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
41、本技术提供了呼吸道合胞病毒的f蛋白突变体，所述rsv f蛋白突变体能够形成三聚体结构并维持在较稳定的融合前体状态，且在使用哺乳动物细胞表达目标蛋白时产量大幅提高，蛋白质稳定性表现优异。其作为疫苗或者疫苗组分使用时具有高免疫原性，能够诱导受免疫动物产生较高的中和抗体水平。本技术所述的rsv f蛋白突变体可用于预防和/或治疗rsv感染，也可以用做呼吸道合胞病毒的检测用试剂。所述突变体用作预防和/或治疗rsv感染时可以单独使用，可以与不同佐剂形成疫苗组合物使用，亦可以与不同类型疫苗产品形成多联疫苗使用。
42、上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如下。
1.一种呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体是将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中含菲林蛋白酶切位点的片段删除。
2.根据权利要求1所述的呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述突变体是将氨基酸序列中第100位与第147位之间28～46个氨基酸删除。
3.根据权利要求1或2所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白从融合前体向融合后体构象转化过程中发生阿尔法螺旋贯通的氨基酸突变为脯氨酸，或任意插入一个或多个脯氨酸，以阻断呼吸道合胞病毒融合f蛋白从融合前体向融合后体发生构象变化，使呼吸道合胞病毒融合f蛋白稳定在融合前体状态。
4.根据权利要求3所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体是进行如下至少一种突变：
5.根据权利要求1～4任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中的一个或多个带电氨基酸突变为极性氨基酸、疏水氨基酸或芳香氨基酸，以释放呼吸道合胞病毒融合f蛋白中的静电斥力，增强呼吸道合胞病毒融合f蛋白融合前体的稳定性。
6.根据权利要求5所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体是进行如下至少一种突变：
7.根据权利要求1～6任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体还包括将呼吸道合胞病毒融合f蛋白的氨基酸序列中的一个或多个小体积氨基酸突变为较大体积疏水氨基酸，以填充融合前体构象的呼吸道合胞病毒融合f蛋白的表面空穴，增强呼吸道合胞病毒融合f蛋白融合前体的稳定性。
8.根据权利要求7所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体是将第67位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸。
9.根据权利要求1～8任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，其特征在于，所述突变体还包括将第509位丝氨酸突变为天冬氨酸；和/或，
10.一种编码权利要求1～9任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体的核酸分子。
11.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求10所述核酸分子。
12.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1～9任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体，或包含权利要求10所述核酸分子，或包含权利要求11所述载体。
13.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1～9任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～9任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体、权利要求13所述疫苗、权利要求10所述核酸分子或权利要求11所述载体。
15.权利要求1～9任一项所述呼吸道合胞病毒融合f蛋白突变体、权利要求10所述核酸分子、权利要求11所述载体、权利要求12所述细胞、权利要求13所述疫苗或权利要求14所述药物组合物在制备检测、预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
