本技术涉及肿瘤免疫治疗领域，更具体地，涉及靶向fap和另一肿瘤相关抗原的免疫效应细胞及其应用。
背景技术：
1、肿瘤特别是实体瘤是由肿瘤细胞及其周围基质细胞和非细胞组分构成的复合体，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与其微环境相互促进、共同演化的一个动态过程，肿瘤微环境在肿瘤的生长转移过程中发挥至关重要的作用。肿瘤相关成纤维细胞(cancer associatedfibroblasts，cafs)，作为肿瘤微环境中最主要的组成成分之一，以表达α平滑肌肌动蛋白(α-sma)和成纤维细胞激活蛋白(fap)为特征，能够分泌多种细胞因子，从而促进肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，打破组织细胞之间的稳态，使微环境更有利于肿瘤成长。cafs对乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等多种常见的癌具有促进作用。近年来，靶向cafs已经逐渐成为癌症治疗的一个新思路。fap特异性表达在cafs细胞中，通过靶向fap可以达到杀伤cafs细胞的效果。
2、car-t细胞的有效性和安全性依赖抗原结合域以及胞内信号转导区的功能。在目前car-t细胞胞内信号转导区的设计已经趋于成熟的现状下，抗原结合区的设计成为新型car-t技术开发的重点和关键。
技术实现思路
1、本技术的目的在于提供一种可以识别fap和肿瘤抗原的融合蛋白，以提高免疫效应细胞对肿瘤细胞如胰腺癌的杀伤作用。
2、本技术对结合fap和cldn18.2的嵌合受体的胞外域进行结构优化，提供了多种靶向fap和cldn18.2的抗原结合域，筛选出能有效抗肿瘤的靶向fap和cldn18.2的抗原结合域。
3、在第一方面，本技术提供一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含双特异性抗原结合域，所述双特异性抗原结合域包括fap抗原结合域和肿瘤抗原结合域。
4、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包括抗原结合域、跨膜域、胞内信号域，所述抗原结合域结构如下：
5、(1)vh1-vl1-vl2-vh2；或
6、(2)vl1-vh1-vh2-vl2；或
7、(3)vh2-vl2-vl1-vh1；或
8、(4)vl2-vh2-vh1-vl1；或
9、(5)vh1-vl2-vh2-vl1；或
10、(6)vh2-vl1-vh1-vl2；或
11、(7)vl1-vh2-vl2-vh1；或
12、(8)vl2-vh1-vl1-vh2，
13、其中“-”为接头，vh1为抗fap抗体vh，vl1为抗fap抗体vl，vh2抗cldn18.2抗体vh，vl2为抗clnd18.2抗体vl。
14、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述vh1包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述vl1包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其中，vh1的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no:4、5、6所示的序列，vl1的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no:1、2、3所示的序列；所述vh2包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述vl2包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其中，vh2的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no:10、11、12所示序列，vl2的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no:13、14、15所示的序列。
15、在一个方式中，vh1的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别为seq id no:4、5、6所示的序列；vl1的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别为seq id no:1、2、3所示的序列；vh2的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别为seq id no:10、11、12所示序列，vl2的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别为seq id no:13、14、15所示的序列。
16、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述vh1，vl1，vh2，vl2分别包括如seq id no：7，8，16，17所示的序列至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
17、在一个方式中，所述vh1，vl1，vh2，vl2分别为与如seq id no：7，8，16，17所示的序列具有至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
18、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述接头选自(g4s)n，其中，n是1、2、3、4或5；或所述接头选自seq id nos:42-45所示的氨基酸序列。
19、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体的抗原结合域包括如seq id no：19、20、21、22、23、24、25、26、或46所示的氨基酸序列的至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
20、在一个方式中，所述嵌合受体的抗原结合域为与seq id no：19、20、21、22、23、24、25、26、或46所示的氨基酸序列具有至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
21、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体选自嵌合抗原受体(car)、重组t细胞受体或合成多肽受体(synnotch)。
22、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述细胞内信号转导结构域包括选自：tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278、或cd66d的胞内信号转导结构域或其组合。
23、其中，所述细胞内信号转导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域(seq id no：37)。
24、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述细胞内信号转导结构域进一步包括共刺激结构域，选自cd137(4-1bb)、cd28、cd27、tnfrsf9、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf14、tnfrsf18、cd40lg、icos、itgb2、cd2、cd7、klrc2、havcr1、lgals9、或cd83的胞内信号转导结构域或其组合。
25、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述共刺激结构选自cd137(4-1bb)的胞内信号转导结构域(seq id no：36)或cd28的胞内信号转导结构域(seqid no：35)。
26、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体的跨膜域选自：cd2、cd3ε、cd3δ、cd3ζ、cd8、cd25、cd27、cd28、cd40、cd79a、cd79b、cd80、cd86、cd95(fas)、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd200r、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd278(icos)、cd279(pd-1)、cd300、cd357(gitr)、a2ar、dap10、fcrα、fcrβ、fcrγ、fyn、gal9、kir、lck、lat、lrp、nkg2d、notch1、notch2、notch3、notch4、ptch2、ror2、ryk、slp76、sirpα、ptα、tcrα、tcrβ、tim3、trim、lpa5或zap70的跨膜域。
27、其中，所述跨膜域为cd28的跨膜域(seq id no：32)或cd8跨膜域(seq id no：33)。
28、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包括cd28跨膜域(seq id no：32)或cd8跨膜域(seq id no:33)、cd28细胞内信号域(seq id no：35)或4-1bb胞内信号域(seq id no:36)、和cd3ζ细胞内信号传导结构域(seq id no：37)。
29、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述胞外域和跨膜域由间隔区连接。其中，所述间隔区选自：cd28铰链区、cd8铰链区、igg间隔区或其片段、或以上组合。其中，所述间隔区为cd8铰链区(seq id no：40)、igg1间隔区(seq id no：38)、或igg4间隔区(seq id no：39)。
30、本技术提供一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包含seq idno：19、20、21、22、23、24、25、26或46所示的融合蛋白，分别与seq id no：28或seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列。
31、例如嵌合受体包含seq id no：19所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：21所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seqid no：22所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：23所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：24所示的融合蛋白与seq idno：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：25所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：26所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：46所示的融合蛋白与seq id no：28所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列。
32、例如嵌合受体包含seq id no：19所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：21所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seqid no：22所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：23所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：24所示的融合蛋白与seq idno：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：25所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：26所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列；嵌合受体包含seq id no：46所示的融合蛋白与seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列。
33、本技术提供一种生物材料，其中，所述生物材料是如下的任意一种：
34、(1)编码上述本技术的嵌合受体的核酸；
35、(2)载体，其包含(1)所述的核酸；
36、(3)病毒，其包含(1)所述的核酸或(2)所述的载体。
37、本技术提供一种细胞，表达上述本技术所述的嵌合受体、上述(1)所述的核酸、和/或上述(2)所述的载体。
38、本技术提供一种细胞，其中，所述细胞包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、多能干细胞、干细胞衍生的免疫细胞或其组合。其中，所述t细胞包括天然的t细胞和/或经多能干细胞诱导产生的t细胞；优选地，所述t细胞包括自体t细胞和/或同种异体t细胞；优选地，所述t细胞为原代t细胞；优选地，所述t细胞来源于人的自体t细胞。
39、本技术提供一种细胞，其中，其还携带外源的细胞因子的编码序列；和/或，其还表达非靶向cldn18.2的嵌合受体；和/或，其还表达趋化因子；和/或，其还表达趋化因子受体；和/或，其还表达安全开关。
40、本技术提供一种药物组合物，包括：本文任一所述的嵌合受体、生物材料、和/或本技术提供任一细胞。
41、本技术提供一种联合用药，其中，本技术任一所述的嵌合受体、细胞、药物组合物与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；和/或与改善其相关的一种或多种副作用的药剂联合施用；和/或与表达靶向除cldn18.2之外的嵌合抗原受体的细胞联合施用。
42、本技术提供一种的本技术任一所述嵌合受体、细胞、药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
43、本技术涉及一种用途，其中，所述肿瘤为在肿瘤微环境中富含大量cafs细胞的肿瘤。优选地，所述肿瘤选自：食管癌、胃癌、肝癌、胆道肿瘤、胰腺癌、肠癌、喉癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、胶质瘤、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、黑素瘤、肉瘤。
1.一种结合fap和cldn18.2的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包括抗原结合域、跨膜域、胞内信号域，所述抗原结合域结构如下：
2.如权利要求1所述的嵌合受体，其中，所述vh1包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述vl1包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其中，vh1的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no:4、5、6所示的序列，vl1的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no:1、2、3所示的序列；所述vh2包含hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述vl2包含lcdr1、lcdr2、lcdr3；其中，vh2的hcdr1、hcdr2、hcdr3分别包含seq id no:10、11、12所示序列，vl2的lcdr1、lcdr2、lcdr3分别包含seq id no:13、14、15所示的序列。
3.如权利要求1或2所述的嵌合受体，其中，所述vh1，vl1，vh2，vl2分别包括与如seq idno：7，8，16，17所示的序列具有至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
4.如权利要求1-3任一所述的嵌合受体，其中，所述接头选自(g4s)n，其中，n是1、2、3、4或5；或所述接头选自seq id nos:42-45所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一所述的嵌合受体，其中，所述嵌合受体的抗原结合域包括与如seq id no：19、20、21、22、23、24、25、26、或46所示的氨基酸序列具有至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段。
6.如权利要求1-5任一所述的嵌合受体，其中，所述嵌合受体选自嵌合抗原受体(car)、重组t细胞受体或合成多肽受体(synnotch)。
7.如权利要求1-6任一所述的嵌合受体，其中，所述细胞内信号转导结构域包括选自：tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278、或cd66d的胞内信号转导结构域或其组合。
8.如权利要求1-7任一所述的嵌合受体，其中，所述细胞内信号转导结构域包括cd3ζ细胞内信号传导结构域(seq id no：37)。
9.如权利要求1-8任一所述的嵌合受体，其中，所述细胞内信号转导结构域进一步包括共刺激结构域，选自cd137(4-1bb)、cd28、cd27、tnfrsf9、tnfrsf4、tnfrsf8、tnfrsf14、tnfrsf18、cd40lg、icos、itgb2、cd2、cd7、klrc2、havcr1、lgals9、或cd83的胞内信号转导结构域或其组合。
10.如权利要求9所述的嵌合受体，其中，所述共刺激结构选自cd137(4-1bb)的胞内信号转导结构域(seq id no：36)或cd28的胞内信号转导结构域(seq id no：35)。
11.如权利要求1-10任一所述的嵌合受体，其中，所述嵌合受体的跨膜域选自：cd2、cd3ε、cd3δ、cd3ζ、cd8、cd25、cd27、cd28、cd40、cd79a、cd79b、cd80、cd86、cd95(fas)、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd150(slamf1)、cd152(ctla4)、cd200r、cd223(lag3)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、
12.如权利要求1-11任一所述的嵌合受体，其中，所述跨膜域为cd28的跨膜域(seq idno：32)或cd8跨膜域(seq id no：33)。
13.如权利要求1-12任一所述的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包括cd28跨膜域(seqid no：32)或cd8跨膜域(seq id no:33)、cd28细胞内信号域(seq id no：35)或4-1bb胞内信号域(seq id no:36)、和cd3ζ细胞内信号传导结构域(seq id no：37)。
14.如权利要求1-13任一所述的嵌合受体，其中，所述胞外域和跨膜域由间隔区连接。
15.如权利要求14所述的嵌合受体，其中，所述间隔区选自：cd28铰链区、cd8铰链区、igg间隔区或其片段、或以上组合。
16.如权利要求15所述的嵌合受体，其中，所述间隔区为cd8铰链区(seq id no：40)、igg1间隔区(seq id no：38)、或igg4间隔区(seq id no：39)。
17.如权利要求1-16任一所述的嵌合受体，其中，所述嵌合受体包含seq id no：19、20、21、22、23、24、25、26或46所示的融合蛋白，分别与seq id no：28或seq id no：29所示的铰链区、跨膜域和胞内域顺序连接的氨基酸序列。
18.一种生物材料，其中，所述生物材料是如下的任意一种：
19.一种细胞，表达权利要求1-17任一所述的嵌合受体、权利要求18中(1)所述的核酸、和/或权利要求28中(2)所述的载体。
20.如权利要求19所述的细胞，其中，所述细胞包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、多能干细胞、干细胞衍生的免疫细胞或其组合。
21.如权利要求20所述的细胞，其中，所述t细胞包括天然的t细胞和/或经多能干细胞诱导产生的t细胞；
22.如权利要求19-21任一所述的细胞，其中，其还携带外源的细胞因子的编码序列；和/或
23.药物组合物，包括：
24.联合用药，其中，权利要求1-17任一所述的嵌合受体、权利要求19-22任一所述的细胞、权利要求23所述的药物组合物与增强其功能的药剂组合施用，优选地，与化疗药物联用；
25.如权利要求1-17任一所述的嵌合受体、权利要求19-22任一所述的细胞、权利要求23所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中，所述肿瘤为在肿瘤微环境中富含大量cafs细胞的肿瘤。
