本发明涉及纳米药物，具体涉及一种三明治核酸纳米器件及其制备方法和应用。
背景技术：
1、癌症是一个重要的公共卫生问题，其全球发病率和死亡率逐年上升。传统的临床肿瘤治疗方法主要包括手术切除、化疗、放疗等。尽管化疗基于其非侵入性和全身肿瘤抑制能力在各种恶性肿瘤的治疗中起着至关重要的作用，但单一化疗几乎无法避免肿瘤复发和转移，同时伴有疗效不足和多种副作用等。研究表明与癌症相关的90％的死亡由肿瘤转移和复发引起。目前化学免疫治疗作为一种联合治疗策略，因其杀死肿瘤细胞的同时激活肿瘤特异性免疫反应的协同抗肿瘤作用而得到迅速发展。阿霉素(dox)、紫杉醇、奥沙利铂(ox)等化疗药物可诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡(icd)，同时细胞表面暴露钙网蛋白(crt)，释放三磷酸腺苷(atp)，分泌高迁移率组盒-1(hmgb1)和促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)，刺激树突状细胞(dcs)的吞噬和成熟，从而促进细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的激活、增殖和肿瘤浸润。然而，仅靠化疗产生的免疫调节作用十分有限，如何产生较强的抗肿瘤免疫应答，至今仍是一个挑战。
2、增强肿瘤特异性免疫应答主要包括两个途径：其一，提高树突状细胞的抗原呈递效率，常用的方法是将icd化疗药物与免疫佐剂结合使用。其中，cpg寡核苷酸是一种未经甲基化修饰的胞嘧啶-鸟嘌呤核酸序列。cpg作为一种良好的免疫佐剂，通过tlr9介导的信号通路激活树突状细胞，促进促炎细胞因子和th1(辅助t细胞)来激活先天免疫反应，用于辅助抗感染和肿瘤治疗等。对于肿瘤免疫疗法，肿瘤细胞是否能够被宿主体内的ctl细胞消除是决定治疗能否成功的关键。肿瘤表面高表达的pd-l1蛋白能够与ctl细胞表面的pd-1受体结合，导致t细胞免疫无能，从而产生免疫逃逸。因此，提高icd免疫治疗疗效的另一个关键途径是如何提高pd-1/pd-l1阻断效率。相较于肿瘤穿透性较差的pd-l1蛋白拮抗抗体而言，一种前瞻性的rna干扰策略可选择作用于肿瘤细胞内部pd-l1基因的小干扰rna(sirna)抑制其蛋白翻译过程，从源头减少肿瘤细胞表面pd-l1的表达，实现免疫检查点抑制效应。
3、然而，通过递送sirna来实现基因沉默仍然面临一系列限制。例如，在血液运输过程中sirna容易被吞噬细胞当作入侵物吞噬降解，另外由于非靶向性与低效内吞，部分sirna最终被肾脏过滤造成了损失。针对上述的各种问题，开发稳定的sirna靶向递送系统是一种很好的解决策略。尽管科研工作者们开发了诸如脂质体等sirna递送系统，然而这些递送系统也存在很多难以克服的缺陷，包括但不限于缺乏体内稳定性，负载药物的化学剂量难以控制等。因此，有效地将sirna和化疗药物递送到肿瘤组织的靶细胞是开发有效癌症联合治疗的首要步骤，为此，寻求更安全、具有更好生物相容性的药物递送系统，以实现化疗药物和sirna的共递送，具有重要的意义。
4、近年来，dna折纸纳米结构因其优越的生物相容性，可编程性，空间寻址的精确性，形状、大小、修饰的灵活性，理化性质稳定性等独特优点在药物递送领域得到广泛应用。先前的报道表明，dna折纸可以有效地装载多种药物，如化疗药物阿霉素(dox)。更重要的是，由于碱基互补配对的特性，小的dna或rna片段可以很容易地整合到dna折纸上，而无需进行任何化学修饰。sirna通过碱基互补配对的结合方式负载在dna折纸上，碱基互补配对是通过氢键结合，其结合强度远远高于在阳离子无机纳米颗粒表面静电吸附sirna，从而减少了体内循环过程中sirna的泄露情况。因此，dna折纸在基因治疗药物递送方面具有得天独厚的优势。综上所述，多功能的dna折纸是sirna和化疗药物协同递送的最佳候选载体之一。现在用于治疗性rna递送的dna折纸纳米结构的几何形状主要局限于一维(纳米棒和纳米管)和二维纳米结构(三角形和矩形纳米板)，其携带的sirnas暴露在这些结构表面，增加了在递送过程中被酶降解的风险。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种三明治核酸纳米器件及其制备方法和应用，以解决现有dna折纸纳米结构在递送过程中，sirnas易被酶降解的问题。
2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种三明治核酸纳米器件，包括：两个dna折纸结构和sirna；每个dna折纸结构的订书钉链在5’端延伸出悬垂单链，悬垂单链通过粘性末端碱基互补配对方式连接sirna。
3、本发明的有益效果为：在dna折纸结构上引入多个悬垂单链，悬垂单链与具有碱基互补粘性末端的sirna通过粘性末端特异性识别而交联成sirna夹心的三明治dna结构，三明治dna纳米结构存在刚性内腔，可在空间上阻碍非必需rnaase降解，从而有效保护血液循环中的sirna。
4、进一步地，两个dna折纸结构中的一个dna折纸结构延伸出的悬垂单链的序列为tcatcgtt和gcactaat；另一个dna折纸结构延伸出的悬垂单链的序列为ccctaactcccctttt和cctccttcctcctttt。
5、进一步地，sirna选自相应的免疫检查点阻断相关基因，可优选为细胞程序性死亡-配体1小干扰rna；sirna双链的序列分别为：
6、sipd-l1-1：aacgaugacaggcguuuacugcugcauaa；
7、sipd-l1-2：aggggaguuaggguuaugcagcaguaaacgccug；
8、sipd-l1-3：auuagugccaggcguuuacugcugcauaa；
9、sipd-l1-4：aggaggaaggagguuaugcagcaguaaacgccug。
10、进一步地，三明治核酸纳米器件还包括核酸适配体和/或免疫佐剂；核酸适配体和免疫佐剂均通过碱基互补配对方式连接在dna折纸结构上。
11、进一步地，核酸适配体为as1411核酸适配体、muc-1核酸适配体或sgc8c核酸适配体；优选为as1411核酸适配体。
12、进一步地，免疫佐剂为cpg。
13、进一步地，三明治核酸纳米器件上还负载有化疗药物；化疗药物为顺铂、喜树碱、盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或药学上可接受的药物中的至少一种。
14、进一步地，dna折纸结构为二维dna折纸结构或三维dna折纸结构；优选dna折纸结构为三角形dna折纸结构。
15、三角形dna折纸结构是通过一条环状长单链的m13噬菌体基因组dna序列和数百条合成的短寡核苷酸序列的订书钉链及抓捕订书钉链按照碱基互补配对原则杂交组装成。
16、上述三明治核酸纳米器件的制备方法包括以下步骤：
17、利用dna折纸技术，制备dna折纸结构，自组装dna折纸结构时引入悬垂单链，合成在订书钉链在5’端延伸出垂悬单链的dna折纸结构，然后通过分层组装，将连接有多个悬垂单链的dna折纸结构与具有碱基互补粘性末端的sirna通过粘性末端特异性识别而交联成sirna夹心的三明治dna结构。
18、本发明的有益效果为：在dna折纸结构上引入多个悬垂单链，悬垂单链是普通未修饰的订书钉链在5’端延伸出来的一小段dna序列，在一锅法自组装dna折纸结构时，悬垂单链的另一端通过碱基互补配对的原理用于合成dna折纸，悬垂单链用于连接功能部件(如sirna、核酸适配体、免疫佐剂等)。
19、进一步，上述制备方法还包括在dna折纸结构上负载化疗药物，得到dna折纸-化疗药物复合体纳米结构；化疗药物通过氢键或静电吸附方式负载到dna折纸结构中；dna折纸结构与化疗药物的摩尔比为1:2×103～1:4×107，优选为1:2×104；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与小干扰rna的摩尔比为1:10～1:150，优选为1:80。
20、进一步地，上述制备方法还包括在dna折纸结构上通过碱基互补配对方式连接核酸适配体和/或免疫佐剂；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与核酸适配体的摩尔比为1:5～1:20，优选为1:6；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与免疫佐剂cpg的摩尔比为1:10～1:50，优选为1:30。
21、进一步地，将dna折纸-化疗药物复合体纳米结构、核酸适配体和/或免疫佐剂混合，先升温至40～45℃，而后降温至20～25℃，每摄氏度保持10～30min；优选先升温至45℃，而后降温至40℃；再升温至25℃，而后降温至20℃，每摄氏度均保持20min。
22、本发明提供的三明治核酸纳米器件可用于制备纳米载药系统、化学免疫治疗药物或医疗产品。
23、本发明具有以下有益效果：
24、本发明通过dna折纸技术构建了一种多功能的以sirna作为桥梁的三明治核酸纳米器件(swac/sipd-l1)。该新型的sirna夹心的三明治dna折纸纳米结构在核酸适配体as1411的作用下，能被肿瘤细胞有效内吞。由于三明治dna纳米结构存在刚性内腔，可在空间上阻碍非必需的rnase降解，从而有效保护血液循环中的sirna。
25、在dswac/sipd-l1共递送体系中，负载的化疗药物dox在酸性溶酶体中释放后，介导的化疗可诱导较强的免疫原性细胞死亡(icd)，促进肿瘤细胞释放抗原，刺激树突细胞(dcs)成熟，免疫佐剂cpg进一步提高树突状细胞的抗原呈递效率，更有效地促进dcs成熟。在dcs向t细胞呈递肿瘤相关抗原后，增强ctls的激活。同时，dswac/sipd-l1纳米体系中dna/rna杂交双链在rnase h酶作用下水解，有效地释放sipd-l1，sipd-l1可以降低肿瘤细胞表面pd-l1的表达，促进细胞毒性t细胞的免疫效应，从而增强适应性免疫。通过小鼠实验(原发肿瘤模型、肺转移肿瘤模型)证实该纳米体系可诱导优异的免疫反应，实现长期的肿瘤抑制。
1.一种三明治核酸纳米器件，其特征在于，包括：两个dna折纸结构和sirna；每个dna折纸结构的订书钉链在5’端延伸出悬垂单链，悬垂单链通过粘性末端碱基互补配对方式连接sirna。
2.根据权利要求1所述的三明治核酸纳米器件，其特征在于，两个dna折纸结构中的一个dna折纸结构延伸出的悬垂单链的序列为tcatcgtt和gcactaat；另一个dna折纸结构延伸出的悬垂单链的序列为ccctaactcccctttt和cctccttcctcctttt。
3.根据权利要求2所述的三明治核酸纳米器件，其特征在于，sirna双链的序列分别为：
4.根据权利要求1～3任一项所述的三明治核酸纳米器件，其特征在于，还包括核酸适配体和/或免疫佐剂。
5.根据权利要求4所述的三明治核酸纳米器件，其特征在于，还包括化疗药物。
6.根据权利要求1～3任一项所述的三明治核酸纳米器件，其特征在于，dna折纸结构为二维dna折纸结构或三维dna折纸结构。
7.权利要求1～6任一项所述的三明治核酸纳米器件的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在自组装dna折纸结构时引入悬垂单链，合成在订书钉链在5’端延伸出垂悬单链的dna折纸结构，然后通过分层组装，将连接有悬垂单链的dna折纸结构与具有碱基互补粘性末端的sirna通过粘性末端特异性识别而交联成sirna夹心的三明治dna结构。
8.根据权利要求7所述的三明治核酸纳米器件的制备方法，其特征在于，还包括在dna折纸结构上负载化疗药物，得到dna折纸-化疗药物复合体纳米结构；dna折纸结构与化疗药物的摩尔比为1:2×103～1:4×107；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与小干扰rna的摩尔比为1:10～1:150。
9.根据权利要求8所述的三明治核酸纳米器件的制备方法，其特征在于，还包括在dna折纸结构上通过碱基互补配对方式连接核酸适配体和/或免疫佐剂；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与核酸适配体的摩尔比为1:5～1:20；dna折纸-化疗药物复合体纳米结构与免疫佐剂的摩尔比为1:10～1:50。
10.权利要求1～6任一项所述的三明治核酸纳米器件在制备纳米载药系统、化学免疫治疗药物或医疗产品中的应用。
