本发明属于肿瘤化学预防，特别是涉及一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法。
背景技术：
1、相关研究显示，近期在肺癌靶向治疗和免疫治疗方面取得了一定进展，但尽管如此肺癌仍然是全球最为致命的癌症。新的治疗进展显著改善了一些非小细胞肺癌(nsclc)患者的预后，但大约60％的nsclc病例缺乏可靶向的驱动突变，只有约20％的病例可以从pd-1或pd-l1治疗中获益。因此，全身化疗仍然是nsclc的主要治疗方法。然而，癌细胞先天能够处理额外的压力，它们可能会对化疗产生耐药性(化疗耐药)。药物外排增加、药物失活以及对药物靶点的修饰，均可导致肿瘤内的药物消除和对化疗药物的适应。
2、细胞中约有三分之一的蛋白质是由内质网(endoplasmic reticulum,er)合成、折叠和运输的，内质网在维持细胞内蛋白质的稳态中起着重要作用。此外，er在控制碳水化合物代谢、脂质生物合成和钙离子稳态等代谢过程中起着关键作用。大量的内部和外部损伤会导致er的完整性受损，其中许多损伤可以激活未折叠蛋白反应(upr)，这是一种缓解er应激并恢复代谢和蛋白质加工功能的信号通路。perk,ire1和atf6是三个在upr期间被激活的er应力传感器。在这些upr传感器中，肌醇调节激酶1(ire1，也称为ern1)是进化上最保守的，在哺乳动物细胞中广泛表达。哺乳动物有两种ire1亚型，分别为ire1α和ire1β，其中ire1α被发现普遍表达，而ire1β的表达仅限于肠细胞。ire1α是一种单跨膜蛋白激酶，也具有核酸酶活性。ire1α依赖性剪接活性负责xbp转录因子(xbp1s)的积累。通过激活xbp1，ire1增加众多er伴侣的表达，从而减少er应激。
3、由于癌症通常在应激微环境中发生和发展，癌细胞可能利用upr激活作为生存策略。事实上，当肿瘤细胞受到营养缺乏和缺氧等环境压力时，upr就会被激活。越来越多的证据表明，upr激活在肿瘤生长和化疗耐药中起着至关重要的作用；upr信号分子与已知的促癌基因和抑癌基因网络相互作用，调节其在癌症发展过程中的功能；了解这些信号通路如何精确地调节彼此的功能，以及它们如何相互依赖将是至关重要的，因此我们提出了一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，解决现有的问题。
2、为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
3、本发明为一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，包括以下步骤：
4、s1、细胞培养：将癌细胞在dmem(hyclone，logan，ut，usa)中培养，添加10％胎牛血清(fbs，gibco brl，grand island，ny，usa)；将癌细胞接种于六孔板中(每孔10-5个细胞)，培养至70％合流，然后按照制造商的说明使用polyjet dna转染试剂(signagen实验室，gaithersburg，md，usa)转染质粒；
5、s2、mtt测定：采用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯基溴化四氮唑(mtt)测定细胞活力，在指定的处理后，细胞进行pbs洗涤；洗涤后的癌细胞在含有mtt溶液(0.5mg/ml)的新鲜培养基中，在37℃的温度下孵育4小时，用dmso溶解所得的甲酰胺晶体，并使用biotek citation 5平板阅读器(biotek，winooski，vt，usa)在570nm波长处测量吸光度；
6、s3、免疫印迹：细胞处理后，使用加热的laemmli样品缓冲液刮擦和均质，所得匀浆然后使用sds-page分离，随后转移到硝化纤维素(nc)膜上(ge healthcare，piscataway，nj，usa)；在应用不同的抗体进行检测后，信号被捕获并使用化学发光系统ai680(proteinsimple，san jose，ca，usa)；
7、s4、双荧光素酶报告基因测定：报告基因构建与renilla荧光素酶载体一起共转染到细胞环境中；随后，利用双荧光素酶报告检测系统(promega)确定萤火虫荧光素酶和renilla荧光素酶的表达水平；
8、s5、定量实时rt-pcr分析：细胞处理后，采用trizor(invitrogen，沃尔瑟姆，usa)提取方法分离细胞rna；随后，利用primescript第一链cdna合成试剂盒(takarabio，大连，中国)逆转录成互补dna(cdna)；tb green mastermix(采购自applied biosystems，thermofisher scientific，ma沃尔瑟姆，usa)在罗氏lightcycler 96平台(罗氏，瑞士)上进行荧光检测；
9、s6、hoechst 33342外排测定：将细胞置于tg(30nm)处理12小时，开始实验；随后，用1xpbs溶液彻底清洗细胞，并用新鲜hoechst培养基(10μg/ml)代替现有培养基；细胞在37℃培养箱中进一步孵育20分钟；在此孵育后将钙通道阻滞剂维拉帕米(10μm)引入实验装置，随后继续孵育10分钟；荧光强度评估采用biotek citation 5系统(由biotek公司生产，winooski，vt，usa)；
10、s7、克隆和dna构建：srebp1启动子从hind iii和kpn i位点插入pgl3-basic(promega，madison，wi，usa)荧光质粒；利用重叠pcr延伸技术的位点特异性诱变将点突变引入srebp1启动子中，以最长的srebp1启动子作为模板；
11、s8、统计分析：采用方差分析进行统计评估(方差分析)通过graphpad prism 6(graphpad软件公司，san diego，ca，usa)。
12、进一步地，所述细胞为人肺腺癌，步骤s1中的培养条件为温度为37°c，含5％co2的加湿环境。
13、进一步地，所述步骤s2中的抗体为anti-atf6(k001590p)、anti-mrp1(k003560p)、anti-gpr78(k000234m)、抗xbp1(a1731)、抗p-ire1α、抗parp(#9542)、抗srebp1(#95879)、抗c-myc(#9402)和抗β-actin(#a1978)。
14、进一步地，所述步骤s4中总结的表达水平显示为从三次重复测量中获得的平均值，并伴有标准差(sd)。
15、进一步地，所述步骤s5中对每个样品进行三次扩增以确保结果的稳健性。
16、进一步地，所述步骤s8中结果以三次不同且重复的实验迭代得出的平均值±标准差(sd)表示；当双尾检验得出的p值低于0.05时，认为达到了统计显著性。
17、本发明具有以下有益效果：
18、本发明通过强调了内质网应激在协调多种信号通路中所起的关键作用，这些信号通路参与了耐药性的调控；这一过程涉及c-myc和srebp的激活，以控制mrp1的表达，以应对急性内质网应激；内质网应激可以诱导对多种化疗药物的耐药程序，这可能对治疗有深远的影响；特别是ire1α-xbp1通路可能表明肺癌的潜在易感性，适合靶向治疗。
19、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
1.一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于，所述细胞为人肺腺癌，步骤s1中的培养条件为温度为37°c，含5％co2的加湿环境。
3.根据权利要求1所述的一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于，所述步骤s2中的抗体为anti-atf6(k001590p)、anti-mrp1(k003560p)、anti-gpr78(k000234m)、抗xbp1(a1731)、抗p-ire1α、抗parp(#9542)、抗srebp1(#95879)、抗c-myc(#9402)和抗β-actin(#a1978)。
4.根据权利要求1所述的一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于，所述步骤s4中总结的表达水平显示为从三次重复测量中获得的平均值，并伴有标准差(sd)。
5.根据权利要求1所述的一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于，所述步骤s5中对每个样品进行三次扩增以确保结果的稳健性。
6.根据权利要求1所述的一种ire1-xbp1信号促进肺癌化疗耐药的方法，其特征在于，所述步骤s8中结果以三次不同且重复的实验迭代得出的平均值±标准差(sd)表示；当双尾检验得出的p值低于0.05时，认为达到了统计显著性。
