本发明涉及分子标记，特别是涉及一种高效棉花基因组特异性kasp引物的开发方法及应用。
背景技术：
1、kasp竞争性等位基因特异pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是一种基于引物末端碱基特异性匹配和终端荧光读取来实现对复杂基因组dna样品中snp位点和indel位点检测的方法。kasp检测与其他snp/indel检测方法相比具有检测通量高、结果准确、应用灵活且成本低等优点，常被应用于功能标记开发、品种真实性纯度鉴定以及qtl精细定位等工作中。棉花是世界上重要的经济作物，为纺织工业提供了大量的天然纤维，脱绒后的棉籽中也是植物蛋白油分的重要来源。随着棉花基因组学的快速发展以及测序技术进步，基因组上大量的snp/indel变异被发现，并且一些位于功能基因内部或者附近的snp/indel，常常与表型性状相关。但是，棉花是四倍体物种，基因冗余性较强，基因组复杂性以及多拷贝，导致了棉花特异性kasp标记开发较为困难，且利用目前的标记开发方法，无法做到特异性筛选，开发的kasp特异性差。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种高效棉花基因组特异性kasp引物的开发方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明的开发方法可以在短时间内开发上万个棉花基因组特异性kasp标记，缩短kasp标记的开发和转化时间，并大大提高棉花kasp标记的特异性，且适用于所有棉种，为棉花基因组snp变异和indel变异的kasp标记转化、棉花种质遗传资源分析研究提供了技术指导。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供了一种高效棉花基因组特异性kasp引物的开发方法，包括如下步骤：
4、(1)获取棉花基因组的snp/indel变异位点，设计原始kasp引物；
5、(2)对所述原始kasp引物进行特异性筛选，得到候选kasp引物；所述特异性筛选的方法为基因组特异性比对法或基因组电子模拟扩增法；
6、所述基因组特异性比对法为：将所述原始kasp引物中的任意一条前引物和通用后引物作为比对对象，与参考基因组进行比对，挑选出前引物或后引物只在参考基因组的一个位置能够比对到的kasp引物，为候选kasp引物；
7、所述基因组电子模拟扩增法为：将原始kasp引物中的任意一条前引物和通用后引物作为e-pcr的引物，挑选出前引物或后引物只在参考基因组的一个位置能够模拟扩增到的kasp引物，为候选kasp引物；
8、(3)对所述候选kasp引物进行基因分型检测，可分型的引物为特异性kasp引物。
9、优选的，步骤(1)中所述原始kasp引物的设计方法为：
10、(a)根据所述snp/indel变异位点的物理位置，获取变异位点上下游200bp的侧翼序列；
11、(b)取snp/indel变异位点上游5’端方向的18～30p序列作为2个前引物；2个前引物分别加上fam接头标签和hex接头标签；
12、(c)在snp/indel变异位点下游3’端方向50～200bp处取一段18～30bp的序列作为通用后引物。
13、优选的，步骤(2)中，所述基因组特异性比对法采用ncbi-blast脚本进行；所述ncbi-blast脚本的evalue阈值设为1，max_target_seqs设为50。
14、优选的，步骤(2)中，所述基因组电子模拟扩增法采用e-pcr软件进行；所述e-pcr软件的margin设为100，wordsize设为9，max mismatches allowed设为0，max indelsallowed设为0。
15、优选的，步骤(3)中所述基因分型检测的方法为：
16、(i)提取棉花样本dna；
17、(ii)以棉花样本dna为模板，进行kasp-pcr。
18、优选的，所述kasp-pcr的反应体系为：dna模板2μl，1×kasp master mix 3μl，kasp引物mix0.2μl；所述dna模板的浓度为20ng/μl；
19、所述kasp-pcr的反应程序为：90～95℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，61～55℃退火并延伸1分钟，10个touch down循环，每个循环退火及延伸的温度下降0.6℃；第二步扩增反应：94℃变性20s，55℃退火并延伸1分钟，26个循环。
20、本发明还提供了上述开发方法在开发棉花特异性kasp标记中的应用。
21、本发明还提供了上述开发方法在棉花snp变异和indel变异的kasp标记转化中的应用。
22、本发明还提供了一种利用上述开发方法得到的棉花基因组特异性kasp标记，所述kasp标记包括如下所述的前引物1、前引物2和通用后引物；
23、
24、
25、
26、
27、
28、本发明还提供了上述棉花基因组特异性kasp标记在棉花种质遗传多样性分析中的应用。
29、本发明提供了一种高效棉花基因组特异性kasp引物的开发方法及应用，公开了以下技术效果：
30、(1)棉花为四倍体物种，基因组拷贝数多，冗余性强，特异性kasp标记开发不易。本发明的开发方法步骤少、操作简单、用时短，其中特异性筛选过程仅需10分钟即可完成，且能够批量开发，在较短时间内可以开发上万个棉花基因组特异性kasp标记，降低了开发难度和成本。
31、(2)本发明方法提高了棉花基因组特异性kasp标记的开发率和转化率。利用本方法得到的特异性kasp标记的开发率可达82％以上，与snp变异、indel变异的位点可以很容易的开发为kasp标记；开发的特异性kasp标记基本都可以用于基因分型，转化率可达90％以上。
32、(3)本发明方法不仅可用于snp-kasp标记的开发，还可以用于indel-kasp标记的开发，且可适用于陆地棉、亚洲棉、海岛棉等多种棉种，应用前景更高，应用价值大。为棉花基因组snp变异和indel变异的kasp标记转化、棉花种质遗传资源分析研究提供了技术指导。
1.一种高效棉花基因组特异性kasp引物的开发方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，步骤(1)中，所述原始kasp引物的设计方法为：
3.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基因组特异性比对法采用ncbi-blast脚本进行；所述ncbi-blast脚本的evalue阈值设为1，max_target_seqs设为50。
4.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基因组电子模拟扩增法采用e-pcr软件进行；所述e-pcr软件的margin设为100，wordsize设为9，max mismatchesallowed设为0，max indels allowed设为0。
5.根据权利要求1所述的开发方法，其特征在于，步骤(3)中，所述基因分型检测的方法为：
6.根据权利要求5所述的开发方法，其特征在于，所述kasp-pcr的反应体系为：dna模板2μl，1×kasp master mix 3μl，kasp引物mix 0.2μl；所述dna模板的浓度为20ng/μl；
7.权利要求1～6任一项所述的开发方法在开发棉花特异性kasp标记中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述的开发方法在棉花snp变异和indel变异的kasp标记转化中的应用。
9.一种利用权利要求1～6任一项所述开发方法得到的棉花基因组特异性kasp标记，其特征在于，所述kasp标记包括如下所述的前引物1、前引物2和通用后引物；
10.权利要求9所述的棉花基因组特异性kasp标记在棉花种质遗传多样性分析中的应用。
