本发明具体涉及遗传工程中的菊苣酸含量相关蛋白及其生物材料和应用。
背景技术：
1、菊苣酸(chicoric acid)是蒲公英、紫锥菊和菊苣等传统药用植物中的重要活性成分。研究表明，菊苣酸有助于植物保护自身免受昆虫侵害及病毒、细菌、真菌和线虫的感染，并且有助于植物机械损伤后的伤口愈合；同时，菊苣酸还具有抗炎、抗氧化、调节免疫、调节糖脂代谢、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等广泛的生物活性。菊苣酸主要从传统药用植物菊苣和紫锥菊中提取，但是由于紫锥菊和菊苣等传统药用植物资源有限，需要大量的土地与人力资源，而且提取菊苣酸单一成分或药用部位，易造成资源浪费；化学合成菊苣酸步骤繁琐，成本较高，而且容易造成环境污染。如何提高植物菊苣酸含量是本领域人员面临的技术问题。
技术实现思路
1、本发明解决的技术问题是提高植物的菊苣酸含量，尤其是菊科植物。
2、为了解决上述问题，本发明提供了下述应用。
3、蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
4、a1)提高菊科植物菊苣酸含量中的应用；
5、a2)制备提高菊科植物菊苣酸含量产品中的应用；
6、a3)制备菊苣酸中的应用；
7、a4)制备菊苣酸产品中的应用；
8、b1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
9、b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
10、b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
11、上述菊科植物可为菊科植物叶片。上述菊科植物可为生菜商品期菊科植物。
12、上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
13、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
14、上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
15、上述蛋白质中，序列2(seq id no.2)由个350个氨基酸残基组成。将其命名为arog175蛋白。其编码基因为arog175基因。
16、上述的应用中，所述蛋白来源于细菌。
17、上文中，所述细菌可为大肠杆菌。
18、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
19、上述的应用中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
20、b1)、编码上述蛋白质的核酸分子；
21、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；
22、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
23、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
24、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
25、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；
26、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。
27、b1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质arog175的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质arog175的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质arog175且具有蛋白质arog175功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
28、上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
29、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
30、本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为pc1300tp2载体。
31、上述生物材料中，b2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和水稻beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
32、上述b3)中，所述重组载体可为用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa、pmdc85或pcambia1391-xb。使用osmak7构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。作为一个具体实施例，本技术使用pc1300tp2载体作为表达载体。
33、作为一个具体实施例，所述重组微生物中的微生物菌株可为农杆菌gv3101。
34、上述的应用中，b3)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的dna分子。
35、为了解决上述问题，本发明还提供了一种培育高菊苣酸含量菊科植物的方法。
36、所述方法包括上调或增强或提高目的菊科植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到高菊苣酸含量菊科植物，所述高菊苣酸含量菊科植物的菊苣酸含量高于所述目的菊科植物。
37、为了解决上述问题，本发明还提供了一种提高菊科植物菊苣酸含量的方法。
38、所述方法包括将通过上调或增强或提高菊科植物中上述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述上述蛋白质的活性和/或含量来提高菊科植物菊苣酸含量。
39、本技术中，所述菊科植物可为生菜。所述生菜可为生菜品系莴苣绿雅。
40、上述的方法中，所述上调或增强或提高菊科植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的菊科植物中导入上述b1)所述的核酸分子、b2)所述的表达盒或b3)所述的重组载体。
41、上文中，所述核酸分子可为序列1所述的核酸分子。
42、如上任一所述的应用或如上任一所述的方法中，所述菊科植物为如下任一种：
43、j1)莴苣属植物；
44、j2)生菜。
45、
46、本技术中，所述生菜可为生菜品系莴苣绿雅。
47、上述的蛋白质或上述的物质。
48、为了解决上述问题，本发明还提供了试剂盒。
49、所述试剂盒包括上述的核酸分子和/或表达盒和/或重组载体和/或重组微生物和/或转基因植物细胞系和/或转基因植物组织和/或转基因植物器官。
50、本发明中，所述生菜商品期为生菜生长至2个月。
51、有益效果
52、生菜是叶用莴苣(lactuca sativa)的俗称，为菊科莴苣属一年或二年生植物，具有易繁殖、生长周期短、适宜栽培地广、栽种条件简单等特性，是世界性的重要叶用蔬菜。由于生菜的再生率和转化率较高，重组蛋白在生菜叶片中可被稳定表达，种子也可长期保存，是外源蛋白及化合物表达的良好宿主。随着合成生物学与代谢工程技术的迅速发展，生菜已作为植物生物反应器被广泛应用于植物基因工程中，再配套一系列现代化的立体、无土栽培等技术，探索利用生菜生成活性天然产物菊苣酸，为开发富含特定活性天然产物的功能性蔬菜奠定基础。
53、本发明公开了菊苣酸含量相关蛋白及其生物材料和应用。解决的技术问题是如何提高菊科植物菊苣酸含量。具体公开了序列2所示蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种；a1)提高菊科植物菊苣酸含量中的应用；a2)制备提高菊科植物菊苣酸含量产品中的应用；a3)制备菊苣酸中的应用；a4)制备菊苣酸产品中的应用。将目的菊科植物中上述蛋白编码基因表达量提高，可增加目的菊科植物菊苣酸含量，可用于工农业生产。
1.蛋白质、上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因表达的物质或上调或增强或提高所述蛋白质的活性或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白来源于细菌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，b3)所述的核酸分子为核苷酸序列为序列1所示的dna分子。
5.一种培育高菊苣酸含量菊科植物的方法，其特征在于，包括上调或增强或提高目的菊科植物中权利要求要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，和/或，所述蛋白质的活性和/或含量，得到高菊苣酸含量菊科植物，所述高菊苣酸含量菊科植物的菊苣酸含量高于所述目的菊科植物。
6.一种提高菊科植物菊苣酸含量的方法，其特征在于，包括将通过上调或增强或提高菊科植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达，和/或，所述权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量来提高菊科植物菊苣酸含量。
7.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高菊科植物中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的菊科植物中导入权利要求3中b1)所述的核酸分子、b2)所述的表达盒或b3)所述的重组载体。
8.如权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于，所述菊科植物为如下任一种：
9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求3中所述的物质。
10.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的核酸分子和/或表达盒和/或重组载体和/或重组微生物和/或转基因植物细胞系和/或转基因植物组织和/或转基因植物器官。
