本发明涉及工程酶，具体涉及一种定向突变的糖基转移酶在半乳糖苷花色苷合成中的应用。
背景技术：
1、花色苷(图2)是花青素的糖苷衍生物，是植物中含量最丰富的水溶性色素，具有抗氧化、保护心血管、抗癌、调节血糖、增强免疫、美容保健等功效，被广泛应用于药品、保健品、化妆品和食品行业。花青素和花色苷的抗氧化活性均强于目前研究公认的强氧化剂维生素c、丁基化羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)和α-生育酚。花色苷在动脉粥样硬化的大鼠模型中表现出对由高脂或高果糖饮食引起的高甘油三酸酯血症、高胆固醇血症(总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇)的预防和保护作用。作为一种天然色素，花色苷或花青素与人工合成的色素相比，更被消费者信赖，从花卉、水果和蔬菜中提取的花色苷或花色素在食品工业中被广泛用作染料和食品着色剂。
2、锦葵素-3-o-半乳糖苷是蓝莓中主要的花色苷之一，也是蓝莓花色苷发挥生物活性的重要组成成分，但是目前锦葵素-3-o-半乳糖苷仅能通过分离纯化的方法制备得到，如中国公开专利cn108822168a中将液相色谱纯化与高速逆流色谱分离技术相结合，从花色苷组成复杂的蓝莓原料中分离制备得到高纯度的锦葵素-3-o-半乳糖苷单体，至今没有关于体外酶法催化合成锦葵素-3-o-半乳糖苷的研究。
技术实现思路
1、本发明提供了一种定向突变的糖基转移酶在半乳糖苷花色苷合成中的应用，可高效催化合成花色苷。
2、本发明提供了一种糖基转移酶突变体，所述糖基转移酶突变体包括在糖基转移酶vc3gt的氨基酸序列的以下至少一个位点发生突变：第82位、第139位和第322位；
3、所述糖基转移酶vc3gt的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、优选的，所述突变包括在以下至少一个位点发生突变：h82a、v139c和k322e。
5、本发明还提供了在糖基转移酶vc3gt中引入点突变h82a的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.3所示的h82a-f和核苷酸序列如seq id no.4所示的h82a-r。
6、本发明还提供了在糖基转移酶vc3gt中引入点突变v139c的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.5所示的v139c-f和核苷酸序列如seq id no.6所示的v139c-r。
7、本发明还提供了在糖基转移酶vc3gt中引入点突变k322e的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.7所示的k322e-f和核苷酸序列如seq id no.8所示的k322e-r。
8、本发明还提供了上述糖基转移酶突变体的编码基因。
9、本发明还提供了包含上述编码基因的重组载体。
10、本发明还提供了包含上述重组载体并表达上所述糖基转移酶突变体的重组表达宿主。
11、本发明还提供了上述的糖基转移酶突变体或上述重组载体或上述重组表达宿主在酶法合成锦葵素-3-o-半乳糖苷中的应用。
12、本发明还提供了一种体外酶法合成锦葵素-3-o-半乳糖苷的方法，以锦葵素和udp-半乳糖苷为底物，利用上述的糖基转移酶突变体或上述重组表达宿主生产的重组蛋白作为催化用酶，进行酶促反应，催化合成锦葵素-3-o-半乳糖苷。
13、有益效果：本发明以糖基转移酶vc3gt为基础酶经定向改造后获得多个发生定点突变的突变体，所述突变体为在基础酶的氨基酸序列的第82位、第139位和第322位氨基酸残基中一个或多个突变为另一种氨基酸残基得到。本发明实施例中验证了突变体h82a、突变体h82a/v139c及突变体h82a/v139c/k322e的合成和催化效率，显示各突变体均可以连接到表达载体上并通过遗传转化的方法，得到可生产对应突变体蛋白的重组表达宿主，且经诱导表达后得到的重组蛋白具有体外酶催化活性，可以图1所示锦葵素和udp-半乳糖苷为底物，经所述酶催化后得到锦葵素-3-o-半乳糖苷，催化方法简单，工艺成本低，适合工业化大规模生产。
1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述糖基转移酶突变体包括在糖基转移酶vc3gt的氨基酸序列的以下至少一个位点发生突变：第82位、第139位和第322位；
2.根据权利要求1所述糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变包括在以下至少一个位点发生突变：h82a、v139c和k322e。
3.在糖基转移酶vc3gt中引入点突变h82a的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.3所示的h82a-f和核苷酸序列如seq id no.4所示的h82a-r。
4.在糖基转移酶vc3gt中引入点突变v139c的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.5所示的v139c-f和核苷酸序列如seq id no.6所示的v139c-r。
5.在糖基转移酶vc3gt中引入点突变k322e的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no.7所示的k322e-f和核苷酸序列如seq id no.8所示的k322e-r。
6.权利要求1或2所述糖基转移酶突变体的编码基因。
7.包含权利要求6所述编码基因的重组载体。
8.包含权利要求6所述重组载体并表达权利要求1或2所述糖基转移酶突变体的重组表达宿主。
9.权利要求1或2所述的糖基转移酶突变体或权利要求7所述重组载体或权利要求8所述重组表达宿主在酶法合成锦葵素-3-o-半乳糖苷中的应用。
10.一种体外酶法合成锦葵素-3-o-半乳糖苷的方法，其特征在于，以锦葵素和udp-半乳糖苷为底物，利用权利要求1或2所述的糖基转移酶突变体或权利要求8所述重组表达宿主生产的重组蛋白作为催化用酶，进行酶促反应，催化合成锦葵素-3-o-半乳糖苷。
