本发明属于昆虫分子鉴定，具体涉及一种同时鉴别棕榈蓟马和西花蓟马的双重pcr检测引物及其方法。
背景技术：
1、目前对于西花蓟马和棕榈蓟马的鉴定主要通过形态鉴定和分子鉴定两种方法。(1)形态鉴定：西花蓟马的鉴定形态主要是头短于前胸，两颊后部略收窄，单眼间鬃着生于前、后单眼外缘连线上，复眼后鬃长，最长的鬃几乎与单眼间鬃等长。触角8节，第ⅰ、ⅲ～ⅴ节前半节褐色后半节色淡，其余各节淡棕色，第ⅲ、ⅳ节具叉状感觉锥。前胸背板共有5对长鬃，前胸前缘角鬃长于前缘长鬃，后缘角具2对长鬃，后缘鬃4对。中胸盾片密布横线纹，后胸盾片前缘具4根长鬃，中央具长形网状线纹，后方有1对钟形感觉孔。前翅前脉鬃约22根，后脉鬃约18根，排列均匀完整。腹部各节前缘线深棕色，第ⅷ节背片后缘梳完整，两侧梳毛较长，中央则较短。棕榈蓟马的鉴定形态主要是头近方形，复眼稍凸出，棕褐色，单眼3个，红色，三角形排列。单眼前鬃1对，位于前单眼之前，单眼间鬃1对，位于单眼间三角形外缘连线之外，即前单眼的两侧各1根。触角7节，第1节淡黄色，第2节橙黄色，第3～5节基部淡黄色，端部褐色，第6～7节褐色，第3～4节有叉状的感觉锥。前胸背板后缘有2对长的后角鬃；后胸背板有1对钟状感觉器，有纵向线形刻纹，不形成网目状，渐次在后部聚合。腹部第2～5节背片上的s2鬃毛与s3鬃毛长度几乎相等；腹部第8背片有完整的栉齿状突起，或称后缘梳。(2)分子鉴定：线粒体细胞色素c氧化酶亚基i，即coi，在同一个动物门中具有比较高的保守性，同时又具有足够的变异，coi基因的保守区和变化区是交替分布在编码链上的这一特点可用来区分亲缘关系比较近的物种。brunner等(2002)根据coi基因序列设计扩增引物，对西花蓟马、烟蓟马和棕榈蓟马等进行扩增均可获得长度为433bp的pcr产物，通过对pcr产物进行测序比对确定蓟马种类。
2、然而蓟马类害虫体型微小、形态相似，难以准确快速区分。现有技术公开了一种蓟马类的分子鉴定技术方法，参考：brunner pc，fleming c，frey je，2002.a molecularidentification key for economically important thrips species(thysanoptera:thripidae)using direct sequencing and a pcr-rflp-based approach.agriculturaland forest entomology，4(2)：127-136.该方法pcr扩增后仍需进行测序比对，测序成本较高。
技术实现思路
1、本发明提供了一种同时特异性鉴别棕榈蓟马和西花蓟马的双重pcr检测引物及其方法，解决了现有技术鉴定蓟马类分子的方法，pcr扩增后仍需进行测序比对，测序成本较高的问题。
2、一种可同时鉴别棕榈蓟马和西花蓟马的双重pcr检测引物，包括西花蓟马特异性引物对fo-f和fo-r以及棕榈蓟马特异性引物对tpk-f和tpk-r；
3、所述的引物fo-f，其核苷酸序列如seq id no.1所示；
4、所述的引物fo-r，其核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、所述的引物tpk-f，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
6、所述的引物tpk-r，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、本发明的第二个目的在于保护用于鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的试剂盒，包括所述的用于同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的双重pcr检测引物。
8、优选的，还包括pcr试剂。
9、本发明的第三个目的在于保护所述的试剂盒在同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马中的应用。
10、优选的，用所述双重pcr检测引物同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的方法为：以待鉴定样本的基因组dna为模板，使用所述双重pcr检测引物对进行扩增，得到扩增产物，根据扩增产物判断待鉴定样本的类型；所述fo-f和fo-r用于特异性扩增西花蓟马；所述tpk-f和tpk-r用于特异性扩增棕榈蓟马。
11、优选的，若扩增产物的核苷酸序列如seq id no.5所示：
12、cttagaaaaatgattgttttcaactaatcataaagatatcggaattctatacttcatttttggattttgatctgggataataggtttatctcttagaataattattcgattaaatttacgaacatcaataaaattatatgtcaataacgatcaattttataattcaattgttacagcacatgcttttattataattttttttacagttatgccaattataattggaggttttggtaattgattagtaccattaatattaggagctcccgatatagcatttccacgattaaataatataagattttgacttcttccaccttctttaaccctcttaattatgggtttatataaagaaggagcaggaacaggatgaacagtttatccacctttatcaacattttatcatgctggaatttcagtagatttaacaattttttctctccatttagctggggtatcctcaattttaggagcattaaatttcatcactacaattttaaatttaaaaaataaaaatctttcaagagaaaaacttagattatttgtgtgatcagttatattaacagcaattcttctgcttttatctttacctgttcttgcaggagccatcacaata，则待测样本为棕榈蓟马；
13、若扩增产物的核苷酸序列如seq id no.6所示：cgacttaatagcataagcttttgacttcttccaccctctttaacattgttaattataggttcatcaaaagatggtgcaggaacaggatgaacagtttacccacctttgtcaactttttatcactctggaccatcagtagatttaactattttttcccttcatttagcaggtatttcttcaattctaggagccttaaattttattacaacgattttaaatttaaagatcaaaaaattaacaacggaaaagataactttatttgtttgatcagttattttaacagctattttattattattgtcgttaccagttttagcaggagctattacaatattattaac gatgtatataagttccgtct，则待测样本为西花蓟马。
14、本发明的第四个目的在于保护所述一种同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的方法，包括以下步骤：
15、提取待鉴定样本的基因组dna；
16、以提取的基因组dna为模板，利用权利要求1所述的西花蓟马特异性引物对fo-f和fo-r以及棕榈蓟马特异性引物对tpk-f和tpk-r进行双重pcr扩增，得到扩增产物；
17、所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；
18、当鉴定结果上显示有1条616bp的条带，则待测样本为棕榈蓟马；当鉴定结果上显示有1条362bp的条带，则待测样本为西花蓟马；当鉴定结果上显示有616bp和362bp的条带，则待测样本为棕榈蓟马和西花蓟马的混合样。
19、优选的，在进行双重pcr扩增时，扩增反应体系为：基因组dna2μl，所述引物fo-f、fo-r、tpk-f和tpk-r的添加量为各0.3μl～1μl，2×taqmastermix10μl，dd h2o补足20μl。
20、优选的，在进行双重pcr扩增时，扩增反应体系中反应程序为：预变性94℃、4min；变性94℃、30s；退火53.8℃～55℃45s；延伸72℃60s，共35个循环；总延伸72℃5min。
21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22、(1)本发明提供的双重pcr体系能够实现在单管反应体系内同时检测两个不同的靶标基因，是可以同时鉴别棕榈蓟马和西花蓟马的双重pcr检测引物及方法。本发明根据西花蓟马和棕榈蓟马coi基因序列分别设计特异性扩增引物，通过同时扩增片段长度的不同进行区分，扩增后不需要再进行测序，相较于现有技术，具有快捷、成本低的优势。
23、(2)本发明设计的双重pcr引物组合及建立的反应体系和反应条件，其特异性强、灵敏度高，利用该双重pcr体系能够实现快速、准确、高效的对棕榈蓟马和西花蓟马进行物种鉴别，可在实际中用于农业害虫和检验检疫中的害虫识别，从而为制定害虫防治策略和检疫提供参考。
1.一种可同时鉴别棕榈蓟马和西花蓟马的双重pcr检测引物，其特征在于，包括西花蓟马特异性引物对fo-f和fo-r以及棕榈蓟马特异性引物对tpk-f和tpk-r；
2.一种用于鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的双重pcr检测引物。
3.根据权利要求2所述用于同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的试剂盒，其特征在于，还包括pcr试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒在同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用所述双重pcr检测引物同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的方法为：以待鉴定样本的基因组dna为模板，使用所述双重pcr检测引物对进行扩增，得到扩增产物，根据扩增产物判断待鉴定样本的类型；所述fo-f和fo-r用于特异性扩增西花蓟马；所述tpk-f和tpk-r用于特异性扩增棕榈蓟马。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，若扩增产物的核苷酸序列如seq id no.5所示，则待测样本为棕榈蓟马；
7.一种同时鉴别西花蓟马和棕榈蓟马的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行双重pcr扩增时，扩增反应体系为：基因组dna2μl，所述引物fo-f、fo-r、tpk-f和tpk-r的添加量为各0.3μl～1μl，2×taqmastermix 10μl，dd h2o补足20μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在进行双重pcr扩增时，反应程序为：预变性94℃、4min；变性94℃、30s；退火53.8℃～55℃45s；延伸72℃60s，共35个循环；总延伸72℃5min。
