本发明属于生物检测，具体涉及一种利福平均相酶免疫检测试剂、制备方法及其使用方法。
背景技术：
1、利福平化学名称为3-(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基甲基利福霉素，化学式为c43h58n4o12，是利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强的抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效，主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染，外用可治疗沙眼等。利福平的化学结构式如式ⅳ所示：
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3、利福平由于其生物利用度及药代动力学的个体差异大，治疗窗范围窄，治疗剂量与中毒剂量接近等因素，导致临床极易发生中毒反应或疗效不佳，需要通过血药浓度监测制定和调整个体化给药方案，以提高利福平应用的安全性和有效性。因此，必须检测利福平在用药患者体内的浓度，为临床制定个体化给药方案提供参考依据。准确、快速的药物浓度检测方法是制定合理给药方案的前提，治疗药物监测方法指导下制定及调整给药方案是药物治疗学发展的必然趋势，它将临床用药从传统经验模式提高到更精准的水平，而精确的检测技术使治疗药物监测临床应用得以实现。经典的治疗药物监测技术主要有光谱法、色谱法、免疫法三类。光谱法由于其灵敏度低、所需样本量大而在临床应用中受到限制；色谱法虽提高了灵敏度，但对样本前处理及所需试剂、样本的纯净度要求均较高，不符合临床快速、简便的操作需求；非均相酶免疫测定法需分离结合与游离的标记物，才能测定各自浓度，操作较为繁琐。以上检测方法都不能适应利福平临床检验的需求，目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的利福平检测试剂，尤其是能快速精确地检测生物样本中微量利福平含量的全自动化检测试剂。因此，研发一种质量达到临床检验要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的利福平检测试剂已成为本领域研究热点。
4、均相酶免疫分析技术是以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为标记酶，主要用来检测生物样本中微量的小分子物质，如小分子药物、毒品、内源性小分子物质(激素、代谢物、有机酸)等。其基本原理是：小分子半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。当试剂中的抗体、酶标半抗原与生物样本混合后，样本中的半抗原与酶标半抗原竞争性地与试剂中的抗体相结合。如样本中的半抗原含量高，与抗体结合的酶标半抗原的比例降低，游离的具有酶活力的酶标半抗原的量就增加。因此在反应后酶活力大小与样本中的半抗原呈一定的比例关系，根据酶活力的测定结果就可推算出样本中半抗原的含量。利福平均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对利福平的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的上述缺陷，提供一种使用方便、灵敏度高、特异性强的利福平均相酶免疫检测试剂、制备方法及其使用方法。应用该利福平均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对利福平含量的全自动化测定，可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中微量利福平的含量，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低利福平检测成本，有利于临床广泛推广使用。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种利福平均相酶免疫检测试剂，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂中包含抗利福平特异性抗体和均相酶底物溶液；所述r2试剂包含利福平酶标偶联物和r2缓冲液。
3、所述的抗利福平特异性抗体，由利福平免疫原免疫实验动物后产生，所述实验动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种；优选地，所述实验动物为兔。
4、所述的利福平免疫原由利福平衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式(ⅰ)所示：
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6、所述的载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白或多聚赖氨酸中的一种；优选地，所述的载体为多聚赖氨酸。
7、所述的利福平酶标偶联物由利福平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)连接而成，其结构式如下述式(ⅱ)所示：
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9、式中g6pdh为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；
10、所述的利福平衍生物，其结构式如下述式(ⅲ)所示：
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12、本发明所述的利福平均相酶免疫检测试剂，制备方法包括以下步骤：(s1.1)r1试剂的制备：将质量分数6.0％的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、6.0％的葡萄糖-6-磷酸、0.3％的牛血清白蛋白、0.03％的nan3的用浓度为60mmol/l、ph＝7.8的tris缓冲液溶解制成均相酶底物溶液；再将抗利福平特异性抗体加入所述均相酶底物溶液中混匀，得到r1试剂，所述抗利福平特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶50～1∶5000。优选地，所述抗利福平特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶800。
13、(s1.2)r2试剂的制备：将质量分数0.3％的牛血清白蛋白、0.03％的nan3用浓度为150mmol/l、ph＝8.0的tris缓冲液溶解制成r2缓冲液，再将利福平酶标偶联物加入所述r2缓冲液中混匀，得到r2试剂，所述利福平酶标偶联物与r2缓冲液的体积比为1∶50～1∶5000。优选地，所述利福平酶标偶联物与r2缓冲液的体积比为1∶100。其中，所述抗利福平特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
14、(s2.1)用浓度为10mmol/l、ph＝7.4的pbs缓冲液将利福平免疫原稀释至8.0mg/ml，得到人工抗原溶液，然后将5.0ml所述人工抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
15、(s2.2)1周后，将步骤(s2.1)中所述的人工抗原溶液用浓度为10mmol/l、ph＝7.4的pbs缓冲液稀释一倍，再将5.0ml稀释后的人工抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物进行注射；
16、(s2.3)之后每隔4周按步骤(s2.2)的方法对上述实验动物进行注射1次，共计注射5次，以加强免疫；
17、(s2.4)对加强免疫后的实验动物进行取血，分离纯化血液得到抗利福平特异性抗体。
18、其中，所述利福平免疫原的制备方法，包括以下步骤：
19、(s3.1)载体溶液的制备：将载体溶解于浓度为0.1-0.3mol/l、ph＝8.5的磷酸钾缓冲液中，载体的终浓度为5-8mg/ml，得到载体溶液；
20、(s3.2)利福平衍生物溶液的制备：将100-300mg权利要求1中式(ⅲ)所示的利福平衍生物，2-6ml二甲基甲酰胺，2-6ml乙醇，3-9ml浓度为10mmol/l、ph＝7.0的磷酸钾缓冲液，100-300mg 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺，30-90mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，搅拌溶解反应60-180min，得到利福平衍生物溶液；
21、(s3.3)利福平免疫原的合成：将步骤(s3.2)得到的利福平衍生物溶液加入到步骤(s3.1)得到的载体溶液中，并在0-8℃下搅拌过夜，再使用10.0mmol/l、ph＝7.0的hepes缓冲液进行透析纯化，得到利福平免疫原。
22、其中，所述利福平酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
23、(s4.1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：将5-25mg的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，3-15mg mgcl2和30-150mg nacl混合溶解于5-25ml浓度为1mol/l、ph＝6.8的tris缓冲液中；再加入100-500mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，50-250mg葡萄糖-6-磷酸，0.3-1.5ml卡必醇和1-5ml二甲基亚砜，搅拌溶解，得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
24、(s4.2)利福平衍生物溶液的制备：将3-15mg权利要求1中式(ⅲ)所示的利福平衍生物溶解于300-1500μl二甲基甲酰胺中，降温至-18℃，加入1.5-7.5μl三丁胺和1-5μl氯甲酸异丁酯，低温搅拌混匀，得到利福平衍生物溶液；
25、(s4.3)利福平酶标偶联物的合成：将步骤(s4.2)得到的利福平衍生物溶液逐滴加入到步骤(s4.1)得到的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，2-8℃搅拌反应过夜，经g-50葡聚糖凝胶层析柱纯化，得到利福平酶标偶联物。
26、其中，上述式(ⅲ)所示的利福平衍生物的合成路线如下：
27、。
28、所述利福平衍生物的合成路线，具体制备步骤如下：
29、将化合物1(3.5g，4.25mmol)溶解于乙腈(70ml)中，然后添加化合物2(0.89g，6.38mmol)制成反应混合物溶液，然后将此反应混合物溶液在室温下搅拌过夜。反应结束后将上述反应混合物溶液进行浓缩，随后通过快速色谱法进行纯化，得到0.5g的利福平衍生物。
30、本发明所述的利福平均相酶免疫检测试剂的使用方法，包括以下步骤：(s6.1)在全自动生化分析仪中加入待测样本、r1试剂，混匀，37℃温育3-5分钟；
31、(s6.2)加入r2试剂，混匀，37℃恒温5-10分钟后，340nm波长进行检测，连续监测3分钟内的吸光度变化率，由全自动生化分析仪自动计算待测样本中利福平的含量；
32、其中，所述的待测样本为生理样本；优选地，所述的生理样本为血清、血浆、尿液、唾液；更优选地，所述的生理样本为血清或血浆。所述r1试剂与r2试剂按1∶1～4∶1的体积比使用；优选地，按4∶1的体积比使用。
33、本发明的有益效果在于：
34、1、本发明所述的利福平衍生物及合成方法均为针对性的新研究与设计，现有技术中并不存在。
35、2、本发明以新研发的利福平衍生物制备得到的利福平免疫原，其免疫原性强于现有技术中制备的常规利福平免疫原；以该利福平免疫原免疫实验动物制备得到的抗利福平特异性抗体，其特异性、灵敏度与现有技术中制备的抗利福平特异性抗体相比都有显著提高，并且与62种常见其它药物无任何交叉反应。
36、3、本发明使用上述抗利福平特异性抗体与利福平酶标偶联物制备得到的利福平均相酶免疫检测试剂的检测灵敏度达到临床检测要求，能准确检测生物样本中微量利福平的浓度；该检测试剂使用方便，可以实现在全自动生化分析仪上对利福平的高通量、快速化检测，其检测的准确性、精密度、灵敏度与特异性都显著高于现有技术；该检测试剂还能有效降低利福平的检测成本，有利于临床推广使用。
1.一种利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂中包含抗利福平特异性抗体和均相酶底物溶液；所述r2试剂包含利福平酶标偶联物和r2缓冲液；
2.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述实验动物为兔。
3.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述的载体为多聚赖氨酸。
4.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述抗利福平特异性抗体与均相酶底物溶液的体积比为1∶800；所述利福平酶标偶联物与r2缓冲液的体积比为1∶100。
6.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述抗利福平特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述利福平免疫原的制备方法，包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述利福平酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂，其特征在于，所述式(ⅲ)所示的利福平衍生物的合成路线如下：
10.一种如权利要求1所述的利福平均相酶免疫检测试剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
